【摘要】：煙草是我國的主要的經(jīng)濟作物,種植區(qū)域廣泛。煙草生產(chǎn)受到多種脅迫因素的限制,其中低溫脅迫對煙草的產(chǎn)量和品質(zhì)的影響最為嚴重。因此,探討煙草對低溫脅迫的分子調(diào)控途徑,提高其對低溫的耐受能力已成為煙草育種工作中的重要任務(wù)。為研究煙草響應(yīng)低溫脅迫的生理和分子基礎(chǔ)及低溫相關(guān)基因TCP基因的主要功能,通過生理生化檢測、高通量測序技術(shù)、qRT-PCR等分子實驗手段,測定了低溫條件下煙草NC567與臺煙8號體內(nèi)的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)以及游離脯氨酸(PRO)、丙二醛(MDA)和脫落酸(ABA)等低溫耐性相關(guān)生理生化指標(biāo),分析并驗證了兩品種中參與低溫脅迫響應(yīng)的miRNAs。隨后構(gòu)建了CRISPR/Cas9定向敲除載體,通過遺傳轉(zhuǎn)化得到了轉(zhuǎn)基因材料。獲得以下主要研究結(jié)果:1.在低溫脅迫處理24 h后,兩個品種中的SOD和CAT活力均有明顯下降,POD的酶活力以及PRO、MDA和ABA等分子的含量均有顯著上升,但只有MDA在臺煙8號中的含量顯著高于NC567,其他指標(biāo)在NC567中的水平都要顯著高于臺煙8號。2.從構(gòu)建的4個樣品的sRNA文庫中均獲得了超過22 M的原始測序數(shù)據(jù),通過比對miRbase鑒定出164個已知的保守miRNAs,分別從NC567和臺煙8號中發(fā)現(xiàn)了25和13個受低溫調(diào)控的保守miRNAs,進一步分析揭示了15個nta-miR169家族成員僅在NC567中下調(diào)表達,而7個nta-miR399成員只在臺煙8號中上調(diào)表達。這兩個品種中受低溫調(diào)控的miRNAs截然不同的表達模式暗示了煙草中miRNA介導(dǎo)的基因型特異性低溫脅迫響應(yīng)機制。根據(jù)研究結(jié)果,建立了基于miRNA水平的煙草低溫脅迫響應(yīng)模型。3.通過構(gòu)建TCP基因的CRISPR-Cas9-TCP定向敲除質(zhì)粒,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草株系K326,最終獲得T0代種子。對T0轉(zhuǎn)基因植株進行測序分析發(fā)現(xiàn),在設(shè)計的三個靶位點處存在隨機缺失多個堿基和增加一個堿基的突變類型。
【學(xué)位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S572

【參考文獻】

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本文編號：2683332