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草莓FvMYB6-like基因的克隆及功能分析

發(fā)布時(shí)間:2020-05-23 18:12
【摘要】:草莓作為一種重要的時(shí)令水果,由于其獨(dú)特的芳香和極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,受到廣大消費(fèi)者喜愛(ài)。果實(shí)顏色是草莓外觀品質(zhì)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)之一,其主要是由花青苷積累導(dǎo)致的;ㄇ嘬盏暮铣墒艿絉2R3-MYB等多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。本研究從二倍體森林草莓(Fragaria vesca)資源‘Ruegen’中分離得到FvMYB6-like基因,構(gòu)建其過(guò)表達(dá)載體,并在擬南芥中實(shí)現(xiàn)FvMYB6-like基因異位表達(dá),初步揭示FvMYB6-like基因具有調(diào)控花青苷合成及生長(zhǎng)點(diǎn)分化的作用。主要結(jié)果如下:(1)利用RT-PCR技術(shù)從森林草莓資源‘Ruegen’中分離獲得FvMYB6-like基因編碼區(qū),CDS共768 bp,編碼255個(gè)氨基酸,等電點(diǎn)為8.60,蛋白質(zhì)分子量為29.22 kD。(2)利用DNAMAN軟件對(duì)FvMYB6-like及其同源基因的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)N末端含有高度保守的R2R3-MYB結(jié)構(gòu)域,另外在R3結(jié)構(gòu)域中含有bHLH基序;在C末端含有C1和C2結(jié)構(gòu)域,表明FvMYB6-like屬于R2R3-MYB家族的第四亞組。(3)將帶有FvMYB6-like和GFP基因的質(zhì)粒在花椰菜花葉病毒(CaMV)組成型啟動(dòng)子35S驅(qū)動(dòng)下,將其導(dǎo)入擬南芥原生質(zhì)體,在激光共聚焦電子顯微鏡下觀察FvMYB6-like亞細(xì)胞定位情況,結(jié)果顯示FvMYB6-like基因定位在細(xì)胞核中,因此該基因編碼一個(gè)核蛋白。轉(zhuǎn)錄活性試驗(yàn)結(jié)果顯示FvMYB6-like在酵母系統(tǒng)中不具有轉(zhuǎn)錄激活活性。(4)在GDR數(shù)據(jù)庫(kù)里找到FvMYB6-like基因啟動(dòng)子序列,利用PlantCARE在線軟件分析,發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子上含有參與花青苷合成的MYB結(jié)合位點(diǎn)(MYBIIG);并在FvMYB10-YW過(guò)表達(dá)植株果實(shí)中檢測(cè)FvMYB6-like基因的表達(dá)量,結(jié)果顯示FvMYB6-like基因表達(dá)量明顯上升;組織特性分析結(jié)果顯示FvMYB6-like基因在葉片、莖和花中表達(dá)量相對(duì)較高,在根和果實(shí)中表達(dá)量相對(duì)較低;在草莓果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期檢測(cè)FvMYB6-like基因表達(dá)結(jié)果顯示,隨著草莓果實(shí)逐漸成熟FvMYB6-like基因的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)。(5)通過(guò)蘸花法將FvMYB6-like基因?qū)霐M南芥,轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株表現(xiàn)出葉片顏色較深,對(duì)葉綠素和花青苷測(cè)定結(jié)果顯示,葉綠素含量在轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中顯著下降,花青苷含量顯著上升。此外,轉(zhuǎn)基因擬南芥表現(xiàn)出2-3個(gè)頂端生長(zhǎng)點(diǎn)(Shoot apical meristem;SAM),且頂端生長(zhǎng)相關(guān)基因表達(dá)量上升。
【圖文】:

植物,轉(zhuǎn)錄因子,蛋白,相互作用


2016)圖 1-1 植物 MYB 轉(zhuǎn)錄因子的分類(lèi)螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋;Ⅰ:1R-MYB/MYB-related;Ⅱ: R2R3-MYB;Ⅲ:3R-MYB;ⅣFigure 1-1 Classification of plant MYB transcription factorH: Helix-turn-helix;Ⅰ: 1R-MYB/MYB-related; Ⅱ: R2R3-MYB; Ⅲ: 3R-MYB; Ⅳ:4R錄因子的功能錄因子可以參與植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝等過(guò)程;騾⑴c多種,蛋白和蛋白之間的互做是調(diào)控植物生長(zhǎng)的一種主要的方相互作用實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的調(diào)控(Singh et al.,1998)。例如,MD40 相互作用形成復(fù)合體調(diào)控植物的次生代謝,同時(shí)也能應(yīng)答子在植物中的作用可以總結(jié)為以下幾個(gè)方面:YB 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育中的作用,MYB 轉(zhuǎn)錄因子參發(fā)育,在根、莖、葉、花、果中均有表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn),擬南芥中

花青苷,鳳丹,生物合成途徑


圖 1-2 花青苷的生物合成途徑(郭鳳丹等,2011)Figure 1-2 Pathway of anthocyanin biosyntheticPAL: 苯丙氨酸解氨酶;C4H: 肉桂酸- 4-羥化酶;CHI: 查爾酮異構(gòu)酶;CHS:查爾酮合酶;4CL: 4-羥基酶 A 連接酶;DFR: 二氫黃酮醇-4-還原酶;F3H: 黃烷酮 3-羥化酶;F3'H: 類(lèi)黃酮 3'-羥化酶;GST: 甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶;UFGT: 尿苷二磷酸葡萄糖-類(lèi)黃酮葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶;RT: 鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶查爾酮合成酶 CHS 作為花青苷生物合成途徑中的一個(gè)重要的酶,,它可以催化 酰輔酶 A 和 4-香豆酰輔酶 A 合成查爾酮。有研究指出在月季中,由于遮光而抑S 的表達(dá)從而導(dǎo)致了花冠不著色(駱菁菁等,2013)。將 CHS 基因?qū)氚珷颗T?CHS 基因表達(dá)紊亂,實(shí)現(xiàn)了內(nèi)源基因與轉(zhuǎn)基因共抑制現(xiàn)象,使矮牽;ㄉ蕵有裕↗orgensen.,1995;化占勇等,2010)。以上可以表明 CHS 的活性與植物苷合成相關(guān)。查爾酮異構(gòu)酶(CHI)在類(lèi)黃酮生物合成中有不可代替的作用,黃色查爾酮由化變?yōu)闊o(wú)色的三羥基黃烷酮。黃烷酮可以合成植物中大部分類(lèi)黃酮類(lèi)物質(zhì)。在花過(guò)抑制 CHI 的活性從而使花青苷合成途徑受到抑制,花青苷合成能力下降(Nishal., 2005)。在園藝植物中,沙梨和蘋(píng)果的果皮中 CHI 的活性和花青苷合成與代
【學(xué)位授予單位】:沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2018
【分類(lèi)號(hào)】:S668.4

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