【摘要】：保加利亞乳桿菌是乳酸菌發(fā)酵劑主體菌株,其在高密度培養(yǎng)過程中會受到由于流加堿法抑制酸而產(chǎn)生的鹽脅迫。前期研究表明外源添加甜菜堿可有效地緩解菌體所受到的脅迫壓力,但是這種方法不能使菌體恢復正常狀態(tài),分析其主要原因是在鹽脅迫條件下,菌體分裂增殖受到影響。目前,以保加利亞乳桿菌應答鹽脅迫引起自身分裂增殖受到影響為切入點的研究很少,因此本課題以保加利亞乳桿菌為研究對象,分析鹽脅迫響應基因的差異表達水平并構(gòu)建突變株,進一步分析相關基因在菌體分裂增殖過程中起到的作用,為保加利亞乳桿菌分裂增殖機理的深入研究奠定一定的理論基礎。本文采用熒光定量PCR手段對信號響應因子和膜轉(zhuǎn)運蛋白等可能對鹽脅迫產(chǎn)生應答的基因進行了相對mRNA表達量分析。研究發(fā)現(xiàn),在鹽脅迫條件下,來自L.bulgaricus 34.5的6個信號響應因子rr1-rr6基因的表達量均有提高,外源添加甜菜堿使這些基因的表達水平下調(diào)。分析5個膜轉(zhuǎn)運基因的表達量發(fā)現(xiàn),L.bulgaricus34.5主要通過調(diào)控初級轉(zhuǎn)運體基因的表達來響應鹽脅迫壓力。其中,膜轉(zhuǎn)運體基因feoA在鹽脅迫條件下表達量上調(diào)了3.59倍,添加甜菜堿后,表達量仍上調(diào)了2.65倍。為研究feoA基因?qū)Ρ＜永麃喨闂U菌分裂增殖的影響,本實驗構(gòu)建了基因敲除表達載體p UC19-F-t,利用同源重組技術,以tet基因為抗性篩選標記,敲除L.bulgaricus 34.5的feoA基因,并從生長曲線、菌體形態(tài)變化和分裂相關基因的差異表達水平等多個方面對feoA基因與菌體生長、分裂增殖的關系進行了初步探討。研究發(fā)現(xiàn),基因feoA的缺失導致L.bulgaricus 34.5的遲滯期被延長了1.5 h,菌體的生物量在生長對數(shù)后期下降了15%,穩(wěn)定期時,恢復到野生株的同期水平。顯微觀察發(fā)現(xiàn),突變體△feoA菌株在對數(shù)生長期呈現(xiàn)出不規(guī)則的彎曲或半圓形的菌體形態(tài),穩(wěn)定期則呈現(xiàn)典型的乳酸菌的密集短桿狀形態(tài)。通過比較分裂相關基因的表達水平發(fā)現(xiàn),L.bulgaricus 34.5野生型菌株在對數(shù)期會顯著地提高基因ftsZ、mbl和mreB的表達水平以適應菌體的高速分裂增殖狀態(tài)。基因feoA的缺失使ftsZ和mreB的表達與野生型相比產(chǎn)生一定的差異,在分裂趨于緩慢的生長對數(shù)后期,這兩種基因的表達量分別下降了0.61倍和0.31倍。推斷基因feoA的缺失能夠通過影響ftsZ和mreB的表達而影響菌體自身的分裂增殖,這種影響體現(xiàn)在突變體△feoA菌株在對數(shù)期生長量下降,形態(tài)異變,但是穩(wěn)定期的菌體不再受到明顯影響。
【圖文】：

哈爾濱工業(yè)大學工學碩士學位論文bulgaricus 34.5 菌體的生長造成了一定的影響；其次，對菌株的表型進行顯微觀察，通過對比野生型與突變型的形態(tài)來判斷目的基因的缺失是否對菌體形態(tài)有影響，使分裂受阻；最后，采用實時熒光定量 PCR 方法檢測分裂相關基因 ftsZ、mreB 和mbl 的表達水平，分析目的基因的缺失是否在轉(zhuǎn)錄水平上對分裂關鍵基因的表達產(chǎn)生了影響，從而影響到菌株進一步的分裂增殖。1.6 技術路線本課題技術路線如下圖 1-1 所示。

本研究所使用的菌株是分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的德式乳桿菌保加利亞亞種 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 34.5，前期實驗已證實這是一株鹽敏感菌株，其亞致死鹽濃度為 0.2 mol/L NaCl，最佳外源甜菜堿（GB）添加濃度為1.2 mmol/L GB。2.1.3.2 大腸桿菌本研究中用于 DNA 克隆的大腸桿菌感受態(tài)細胞是 Escherichia Coli DH 5α，購自寶日醫(yī)生物技術有限公司。2.1.3.3 質(zhì)粒（1）本研究使用的抗性基因由質(zhì)粒 pBR322 提供。pBR322 質(zhì)粒具有四環(huán)素抗性，通過 PCR 擴增獲得該質(zhì)粒上的四環(huán)素抗性基因。購自北京索萊寶生物科技有限公司。（2）本研究所使用的敲除質(zhì)粒是 pUC19，該質(zhì)粒為氨芐青霉素抗性，長度為2686 bp，具有編碼 lacZ 蛋白氨基末端的部分序列，在大腸桿菌感受態(tài)細胞 E. ColiDH 5α 中可以表現(xiàn)出 α-互補現(xiàn)象，，從而通過藍白斑篩選，獲得重組克隆子。購自寶日醫(yī)生物技術有限公司。
【學位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：TS201.3

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本文編號：2676399