【摘要】：小麥莖稈是獲得高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)的物質(zhì)基礎(chǔ),但是當(dāng)前小麥育種利用的莖稈發(fā)育調(diào)控基因主要為矮稈基因,其遺傳基礎(chǔ)日益狹窄。誘發(fā)突變技術(shù)可拓寬小麥的遺傳基礎(chǔ),發(fā)掘新的調(diào)控小麥莖稈發(fā)育的優(yōu)良基因。本實(shí)驗(yàn)室前期利用~7Li離子束誘變輪選987(LX987)獲得了一個(gè)快速發(fā)育突變體(qucik development mutant,qd),與野生型相比,qd拔節(jié)后的莖稈發(fā)育速率和強(qiáng)光誘導(dǎo)下的胚芽鞘顏色表現(xiàn)出明顯的表型差異。本研究綜合利用BSR-Seq、轉(zhuǎn)錄組和660K SNP芯片等技術(shù)對(duì)控制突變體的莖稈快速發(fā)育性狀的基因(命名為qd1)以及強(qiáng)光誘導(dǎo)下的花青素合成基因進(jìn)行初步定位。主要研究結(jié)果如下:1、小麥莖稈快速發(fā)育基因qd1的初定位。以輪選987×qd的F_2群體為材料,利用BSR-Seq技術(shù)在4B染色體上得到一個(gè)總長為13.55 Mb的區(qū)域,15.41 Mb-28.96 Mb。針對(duì)BSR-Seq開發(fā)的SNP,在目標(biāo)區(qū)間篩選到了16個(gè)KASP(kompetitive allele specifc PCR)標(biāo)記。在F_2群體的153株隱性單株中,利用這些KASP標(biāo)記對(duì)定位區(qū)間進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果表明與BSR-Seq得到的初定位區(qū)間有2.16 Mb的重疊區(qū)域(26.80 Mb-28.96 Mb),更進(jìn)一步縮小qd1初定位區(qū)間至5.08 Mb(26.80 Mb-31.88 Mb)。2、野生型與突變體的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集分析表明苯并惡嗪類生物合成通路顯著富集差異表達(dá)基因。赤霉素合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中,內(nèi)根-古巴焦磷酸合成酶(ent-copalyl diphosphate synthase,CPS)和GA20ox出現(xiàn)了差異表達(dá)基因的富集。將每種酶對(duì)應(yīng)的所有差異表達(dá)基因的表達(dá)量FPKM(fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped)值進(jìn)行加和后,發(fā)現(xiàn)在突變體赤霉素合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中,GA20ox表達(dá)量出現(xiàn)大幅下調(diào),推測孕穗期突變體莖稈伸長速率降低可能是由于該時(shí)期突變體GA20ox表達(dá)量的大幅下降引起的。3、突變體中受強(qiáng)光誘導(dǎo)的花青素合成基因的初定位。利用660K SNP芯片,發(fā)現(xiàn)兩個(gè)F_2群體(輪選987×qd,航麥247×qd)都在7A染色體存在三個(gè)一致的多態(tài)性SNP富集區(qū)。其中260Mb-290 MB區(qū)間多態(tài)性SNP富集的比例在兩個(gè)群體中均不低于30%,位于285 Mb處的R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子最有可能為候選基因。研究表明,綜合利用BSR-Seq和660K SNP芯片技術(shù)可對(duì)控制小麥莖稈發(fā)育速率和胚芽鞘花青素合成的關(guān)鍵基因進(jìn)行快速分析定位。研究結(jié)果為拓寬小麥莖稈發(fā)育調(diào)控基因的遺傳資源和深入解析花青素的生理功能奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

94℃預(yù)變性 15 min；（2）94℃變性 20 s，61-55℃退火延伸 1 min（每循環(huán)降低 0.6℃），持續(xù) 10個(gè)循環(huán)；（3）94℃變性 20 s，55℃退火延伸 1 min，進(jìn)行 26 個(gè)循環(huán)；（4）37℃持續(xù) 1 min 后進(jìn)行熒光采集實(shí)現(xiàn) SNP 基因分型。2.2 結(jié)果與分析2.2.1 測序數(shù)據(jù)與參考基因組的比對(duì)以及高質(zhì)量 SNP 的篩選測序產(chǎn)生出的原始數(shù)據(jù)去除測序接頭、引物序列以及過濾低質(zhì)量 reads 后，共得到 402.04 Mb雙端 reads（對(duì)應(yīng) 118.40 Gb Clean Data）。其中親本 reads 數(shù)目均不低于 25.40 Mb（7.49 Gb），混池 reads 數(shù)目均不低于 107.01 Mb（31.53 Gb）。各樣品 Q30 堿基百分比均不低于 94.9%，見附表A1。GATK 軟件將親本和混池的 Clean Reads 與參考基因組進(jìn)行比對(duì)后，共發(fā)掘出 393,257 個(gè) SNP位點(diǎn)，利用四個(gè)標(biāo)準(zhǔn)過濾后，得到高質(zhì)量 SNP 位點(diǎn) 38,299 個(gè)（其中有 692 個(gè) SNP 沒有比對(duì)到染色體），平均每 380 kb 一個(gè) SNP，每條染色體平均覆蓋 1790 個(gè) SNP，見圖 2.1。SNP 個(gè)數(shù)小于 1000的染色體有 2B、2D、3D、4A、4D、5D 和 7D。6B 和 3B 染色體上 SNP 數(shù)目最多，分別達(dá)到了4299 和 4209 個(gè)。4B 染色體上共有 1616 個(gè) SNP，平均每 417 kb 一個(gè) SNP。

對(duì)應(yīng) Mix-D 的 SNP-index 均值為 0.80。理論上隱性混池目標(biāo)區(qū)間所有 SNP 的 SNP-index 值應(yīng)為 1，但是混池 Mix-D 在目標(biāo)區(qū)間的最大 SNP-index 值為 0.81，可能是于 QTL 極易受環(huán)境或遺傳背景的影響致使選擇極端矮稈表型時(shí)混入了其他基因型的單株。F2群體對(duì) qd1 初定位區(qū)間的驗(yàn)證見圖 2.3。利用目標(biāo)區(qū)間 SNP 信息開發(fā)的 16 個(gè) KASP 標(biāo)記，對(duì) 153 株 F2隱性單株進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)了 59 個(gè)重組子，其中 31.88 Mb、37.70 Mb 和 41.01 Mb 處，各有一個(gè)關(guān)鍵重組子，這三個(gè)重組子表明 qd1 位于 26.80 Mb-31.88 Mb 之間，共計(jì) 5.08 Mb 區(qū)間。這個(gè)結(jié)果與 QTL-Seq 得到的初定位區(qū)間有 2.16 Mb 的重疊區(qū)域（26.80 Mb-28.96 Mb），驗(yàn)證了QTL-Seq 得到定位區(qū)間的準(zhǔn)確性，更進(jìn)一步縮小 qd1 候選區(qū)間至 5.08 Mb（26.80 Mb-31.88 Mb）。實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果表明 qd 的 Rht-B1 基因的 190 位發(fā)生了 T-C 的轉(zhuǎn)換，造成其編碼的DELLA 蛋白的終止密碼子 TAG 回復(fù)突變?yōu)榫幋a谷氨酰胺的 CAG，因此 qd 的 DELLA 蛋白恢復(fù)為 621 個(gè)氨基酸長度，其與赤霉素的互作功能也恢復(fù)正常，，表現(xiàn)為對(duì)赤霉素敏感（張寧, 2016）。利用 Rht-B1 的 KASP 標(biāo)記（位于 30.86 Mb）對(duì)隱性單株進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明該標(biāo)記沒有重組子（圖 2.3），因此 qd1 很有可能位于 Rht-B1a 基因附近。在參考基因組的注釋中，qd1 定位區(qū)間（26.80Mb-31.88 Mb）包括 Rht-B1a 基因在內(nèi)，共有 70 個(gè)基因，但是并沒有與赤霉素的生物合成功能相關(guān)的基因，只有兩個(gè)編碼 F-box 蛋白的基因可能與赤霉素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能有關(guān)。這 70 個(gè)基因的詳細(xì)注釋信息見附表 A3。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S512.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2669625