發(fā)布時(shí)間：2020-05-15 15:30

【摘要】：目的:觀察西酞普蘭(citalopram)對(duì)3xTgAD小鼠認(rèn)知功能障礙的改善作用,探討西酞普蘭神經(jīng)保護(hù)作用的可能機(jī)制。方法:將5月齡雌性三轉(zhuǎn)基因(3xTg)阿爾茨海默病(AD)小鼠與野生型小鼠(wild type,WT)隨機(jī)分為以下四組:野生型對(duì)照組(WT+Water)、野生型治療組(WT+Citalopram)、轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M(3xTgAD+Water)和轉(zhuǎn)基因治療組(3xTgAD+Citalopram)。每組小鼠11-12只。從5月齡起在小鼠飲水中加入或不加入藥物西酞普蘭(濃度0.06mg/ml),小鼠經(jīng)飲水?dāng)z入藥物,共持續(xù)3個(gè)月。小鼠從7月齡起開始進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn):(1)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)將小鼠置于曠場(chǎng)中央,讓其自由探索5分鐘,記錄小鼠運(yùn)動(dòng)距離及中央?yún)^(qū)域探索時(shí)間;(2)Y迷宮自發(fā)交替實(shí)驗(yàn)將小鼠置于三臂交匯處,自由探索8 min,記錄小鼠進(jìn)臂的總次數(shù)以及每次進(jìn)臂的順序,計(jì)算小鼠進(jìn)臂正確率;(3)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)分為定位航行試驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)兩部分,分別記錄小鼠尋找平臺(tái)的逃避潛伏期、穿過平臺(tái)所在位置的次數(shù);(4)高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)將小鼠置于迷宮中,令其自由活動(dòng)5min,記錄其移動(dòng)的總距離及在開放臂中停留的時(shí)間;(5)懸尾實(shí)驗(yàn)將小鼠尾巴懸掛在鉤上5min,記錄小鼠不動(dòng)時(shí)間。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,每組小鼠隨機(jī)取6只進(jìn)行在體海馬長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)實(shí)驗(yàn)。腹腔水合氯醛麻醉小鼠,將其固定于腦立體定位儀上。在顱骨上鉆孔,將同心圓刺激電極置于海馬Schaffer側(cè)枝/聯(lián)合纖維通路上,記錄電極置于海馬CA1區(qū)。使用電刺激器及配套的隔離器產(chǎn)生電刺激信號(hào),記錄電極拾取海馬CA1區(qū)放射層興奮性突觸后電位(fEPSPs),經(jīng)多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)放大。先給予每30秒1次的測(cè)試刺激至少15min,以得到穩(wěn)定的基礎(chǔ)性突觸傳遞。然后,使用高頻刺激(HFS)誘導(dǎo)fEPSPs的LTP。HFS之后,繼續(xù)記錄fEPSPs,持續(xù)至少1h。將HFS后的fEPSPs斜率相對(duì)基礎(chǔ)水平斜率進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,繪制fEPSPs斜率變化與時(shí)間的關(guān)系曲線,并計(jì)算各組小鼠HFS后0-10min和21-60min的曲線下面積(AUC)。HFS之前進(jìn)行雙脈沖易化(PPF)實(shí)驗(yàn),分析突觸前功能變化。電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,取小鼠海馬及大腦皮層新鮮組織進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn):(1)ELISA實(shí)驗(yàn)使用ELISA方法測(cè)量3xTgAD小鼠海馬及皮層Aβ含量,根據(jù)ELISA試劑盒的說明書操作;(2)Western blot實(shí)驗(yàn)使用12%SDS-PAGE電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)至PVDF膜,使用一抗結(jié)合APP、CTFβ及β-actin,二抗結(jié)合一抗后用ECL顯色,用Image J分析。實(shí)驗(yàn)使用雙因素方差分析或三因素重復(fù)測(cè)量方差分析進(jìn)行多個(gè)均數(shù)的比較。使用t檢驗(yàn)比較兩組均數(shù)間的差異。P0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:(1)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn):3xTgAD小鼠運(yùn)動(dòng)距離小于WT小鼠(P0.001),西酞普蘭可增加WT小鼠的運(yùn)動(dòng)距離(P=0.017),但不影響轉(zhuǎn)基因小鼠的運(yùn)動(dòng)距離(P=0.123);3xTgAD小鼠較WT小鼠在曠場(chǎng)中央停時(shí)間明顯增多(P=0.009),西酞普蘭對(duì)WT(P=0.308)和3xTgAD小鼠(P=0.290)在中央?yún)^(qū)的探索時(shí)間均無影響。(2)高架十字迷宮實(shí)驗(yàn):3xTgAD小鼠運(yùn)動(dòng)距離小于WT小鼠(P=0.003),西酞普蘭對(duì)WT小鼠(P=0.106)與3xTgAD小鼠(P=0.827)的運(yùn)動(dòng)距離都無影響;3xTgAD小鼠在開放臂停留時(shí)間較WT小鼠明顯延長(zhǎng)(P=0.012),但西酞普蘭并未影響WT(P=0.387)與3xTgAD小鼠(P=0.184)在開放臂的停留時(shí)間。(3)懸尾實(shí)驗(yàn):各組小鼠不動(dòng)時(shí)間沒有顯著差異(P0.05)。(4)Y迷宮自發(fā)交替實(shí)驗(yàn):3xTgAD小鼠的進(jìn)臂次數(shù)少于WT小鼠(P0.001),西酞普蘭不影響WT(P=0.395)及3xTgAD小鼠(P=0.925)的進(jìn)臂次數(shù);各組小鼠進(jìn)臂正確率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。(5)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn):在定位航行試驗(yàn)中,各組小鼠的逃避潛伏期隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加而縮短(P0.001);在5天訓(xùn)練過程中,3xTgAD小鼠的逃避潛伏期明顯長(zhǎng)于WT小鼠(P0.05),西酞普蘭能明顯縮短3xTgAD小鼠延長(zhǎng)的逃避潛伏期(P0.05);在空間探索試驗(yàn)中,3xTgAD小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)明顯少于WT小鼠(P=0.004),西酞普蘭能顯著增加3xTgAD小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)(P=0.003)。(6)在體海馬LTP記錄:各組小鼠0-10min AUC之間不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);3xTgAD小鼠21-60min AUC明顯低于WT小鼠(P=0.010);西酞普蘭治療后3xTgAD小鼠21-60minAUC明顯增加(P=0.047);各組小鼠fEPSP2/fEPSP1比值沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。(7)ELISA實(shí)驗(yàn):3xTgAD小鼠海馬及皮層組織可溶性Aβ含量由于低于ELISA試劑盒的檢測(cè)下限而未得出有意義的結(jié)果;轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)西酞普蘭治療后海馬、大腦皮層不溶Aβ_(40)含量顯著低于未治療組(P=0.018,P=0.0348);西酞普蘭治療與否不影響3xTgAD小鼠海馬及大腦皮層不溶Aβ_(42)的含量(P0.05)。(8)Western blot實(shí)驗(yàn):3xTgAD小鼠海馬組織APP、CTFβ含量高于WT小鼠(P=0.001,P0.001),西酞普蘭能顯著降低3xTgAD小鼠海馬APP、CTFβ水平(P=0.018,P=0.023)。結(jié)論:(1)7-8月齡雌性3xTgAD小鼠工作記憶正常,但空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯受到傷害;慢性經(jīng)口給予西酞普蘭可改善3xTgAD小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。(2)7-8月齡雌性3xTgAD小鼠表現(xiàn)出淡漠樣、去抑制樣行為,西酞普蘭對(duì)上述精神行為異常無效;7-8月齡雌性3xTgAD轉(zhuǎn)基因小鼠未表現(xiàn)出抑郁樣行為;(3)西酞普蘭慢性經(jīng)口給藥能減輕雌性3xTgAD小鼠海馬CA1區(qū)突觸可塑性傷害;(4)西酞普蘭慢性經(jīng)口給藥能減少雌性3xTgAD小鼠海馬及皮層組織Aβ含量,這種減少可能是通過下調(diào)APP的表達(dá)或增強(qiáng)α分泌酶活性而實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R749.16

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本文編號(hào)：2665254