【摘要】：小麥(Triticum aestivum L.)是主要的糧食作物。分蘗是包括小麥在內(nèi)的單子葉禾本科植物最重要的農(nóng)藝性狀之一,直接影響小麥結(jié)實(shí)進(jìn)而影響單產(chǎn),因此小麥的分蘗研究具有重要的發(fā)育生物學(xué)意義。水稻(Oryza sativa L.)的MOC1基因是控制其分蘗的發(fā)生及分蘗芽生長(zhǎng)的關(guān)鍵基因。本課題組前期已分離了TaMOC1基因,并對(duì)其表達(dá)模式及功能進(jìn)行了初步探究�；虮磉_(dá)的調(diào)控包括轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控和翻譯后蛋白水平的調(diào)控等,但轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是最重要的,而啟動(dòng)子的調(diào)控作用在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控是最重要的。因此,啟動(dòng)子的序列、結(jié)構(gòu)及其功能元件的研究對(duì)于了解基因表達(dá)調(diào)控原理非常重要。在本課題的研究中,我們克隆了TaMOC1的啟動(dòng)子序列并對(duì)它的序列結(jié)構(gòu)及作用元件進(jìn)行初步分析。同時(shí),為了深入探究TaMOC1的功能,我們利用CRISPR/Cas的方法構(gòu)建TaMOC1定點(diǎn)突變的表達(dá)載體,以小麥幼胚為材料,進(jìn)行小麥遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。具體研究結(jié)果如下:(1)半定量實(shí)驗(yàn)的分析結(jié)果顯示TaMOC1-7A、TaMOC1-7B、TaMOC1-7D在根、莖尖、葉和小穗中均有表達(dá),其中在莖尖中TaMOC1-7B表達(dá)量較高。(2)TaMOC1-7A、TaMOC1-7B、TaMOC1-7D的啟動(dòng)子序列順式作用元件的分析結(jié)果顯示它們啟動(dòng)子中含有多種調(diào)控元件。分蘗受多種因素影響。因此我們推測(cè):TaMOC1啟動(dòng)子可能通過(guò)多種激素誘導(dǎo)調(diào)控TaMOC1表達(dá),并與逆境脅迫信號(hào)途徑有關(guān),并且TaMOC1啟動(dòng)子可能通過(guò)與分生組織表達(dá)有關(guān)的順式調(diào)控元件參與TaMOC1調(diào)控小麥分蘗。(3)P_(TaMOC1-7D)::GUS、P_(TaMOC1-7D)P1::GUS、P_(TaMOC1-7D)P2::GUS擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明CAT-box調(diào)控元件決定了TaMOC1的表達(dá)部位,對(duì)于TaMOC1啟動(dòng)子的活性有重要意義。(4)我們得到了5株pBUE411-TaMOC1-Cas9 T0代轉(zhuǎn)基因植株,植株育性較差。同時(shí),我們已獲得部分T1代轉(zhuǎn)基因植株測(cè)序結(jié)果,測(cè)序結(jié)果表明TaMOC1突變體植株的靶位點(diǎn)序列處部分核苷酸序列發(fā)生了改變,造成其氨基酸序列發(fā)生了變化,進(jìn)一步的定量PCR結(jié)果顯示TaMOC1的表達(dá)量明顯下調(diào)。下一步我們將對(duì)P_(TaMOC1-7D)::GUS轉(zhuǎn)基因T2代植株進(jìn)行大量GUS染色及相關(guān)組織切片分析,進(jìn)一步確定TaMOC1的表達(dá)模式。此外,我們將對(duì)pBUE411-TaMOC1-Cas9轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行大田種植,分別對(duì)其冬前及拔節(jié)期分蘗情況、穗發(fā)育及結(jié)實(shí)情況進(jìn)行觀(guān)察,確定TaMOC1對(duì)小麥分蘗的作用。
【圖文】：

圖 1-1 CRISPR 位點(diǎn)結(jié)構(gòu)圖Fig. 1-1 CRISPR site map/Cas 系統(tǒng)的工作原理物 RNA 干擾（RNAi）原理相似，CRISPR/Cas 系統(tǒng)，通過(guò)的表達(dá)被沉默（Zhang et al., 2016）。首先，CRISPR/Cas 系碼的蛋白的協(xié)助下，找到與間隔序列互補(bǔ)的外源 DNA 序列r）。原間隔序列的選取并不是隨機(jī)的，它的兩端都有幾個(gè)非常序列臨近基序的 PAM（protospacer adjacent motif，PAM）（ 通常由 NGG 三個(gè)堿基構(gòu)成（N 為任意堿基）（Feng et al., 2合物將原間隔序列從外源 DNA 剪切下來(lái)，并在其他酶的協(xié) 序列的前導(dǎo)區(qū)的下游（Liang et al., 2018）。隨后，，DNA 將打段新的間隔序列就被添加到了基因組 CRISPR 序列。然后，調(diào)控下合成 pre-CRISPR-derived RNA（pre-crRNA）和 tran

小麥 TaMOC1 基因的啟動(dòng)子分析及 CRISPR-Cas9 突變體的獲得3 結(jié)果與分析3.1 TaMOC1-7A、TaMOC1-7B、TaMOC1-7D 的表達(dá)模式分析小麥 TaMOC1-7A、TaMOC1-7B、TaMOC1-7D 三個(gè)基因來(lái)源于不同的祖先，其表達(dá)模式可能存在差異。我們選取了幼根、幼葉、三葉一心時(shí)期的莖尖及小花小穗原基分化期的小穗原基為材料，對(duì) TaMOC1-7A、TaMOC1-7B、TaMOC1-7D 分別了設(shè)計(jì)特異引物RTQPTaMOC1-7A-F/RTQPTaMOC1-7A-R 、 RTQPTaMOC1-7B-F/RTQPTaMOC1-7B-R 和RTQPTaMOC1-7A-F/RTQPTaMOC1-7A-R 通過(guò)半定量實(shí)驗(yàn)對(duì)它們進(jìn)行表達(dá)模式分析，結(jié)果顯示TaMOC1-7A、TaMOC1-7B、TaMOC1-7D 在根、莖尖、葉和小穗中的表達(dá)模式均有表達(dá)，其中在莖尖中 TaMOC1-7B 表達(dá)量最高（圖 3-1）。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：Q943.2;S512.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2656503