【摘要】：玉米是我國(guó)的主要糧食作物,但是蟲(chóng)害和雜草的危害對(duì)于玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)有著極大的威脅,使玉米減產(chǎn)并造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的迅速發(fā)展,轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)耐除草劑復(fù)合性狀玉米成功地解決了蟲(chóng)害和雜草的雙重危害。但是隨著cry基因的發(fā)展,害蟲(chóng)也在逐漸地對(duì)抗蟲(chóng)蛋白表現(xiàn)出一定抗性。因此,尋找新的基因可以擴(kuò)大抗蟲(chóng)基因的抗蟲(chóng)譜,在原有的抗蟲(chóng)基因基礎(chǔ)上進(jìn)行改造可以得到新的抗蟲(chóng)基因。利用密碼子優(yōu)化和基因改造的方法對(duì)cry1Ab基因進(jìn)行了改造,并且得到了新的抗蟲(chóng)基因cryNGc。轉(zhuǎn)cryNGc和bar基因的轉(zhuǎn)基因玉米吉抗309已經(jīng)進(jìn)入到了申請(qǐng)環(huán)境釋放階段,這就需要我們對(duì)吉抗309轉(zhuǎn)基因玉米的遺傳穩(wěn)定性和環(huán)境安全進(jìn)行分析和評(píng)價(jià),本文經(jīng)過(guò)試驗(yàn)得到以下結(jié)果:通過(guò)PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米吉抗309植株體內(nèi)的cryNGc基因和bar基因進(jìn)行了檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果為兩種基因均存在于轉(zhuǎn)基因玉米中。為了進(jìn)一步驗(yàn)證兩種基因是否能正常轉(zhuǎn)錄,利用RT-PCR的方法進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示,兩種基因都能正常轉(zhuǎn)錄;Southern blot結(jié)果證明了目的基因在轉(zhuǎn)基因玉米中以單拷貝形式存在,具有一定的遺傳穩(wěn)定性;利用熱不對(duì)稱(chēng)交錯(cuò)PCR尋找到轉(zhuǎn)基因玉米的側(cè)翼序列并設(shè)計(jì)特異性引物建立了該轉(zhuǎn)基因玉米的特異性檢測(cè)方法。通過(guò)試紙條檢測(cè)、蛋白表達(dá)和純化、SDS-PAGE、Western blot和質(zhì)譜檢測(cè)的試驗(yàn)方法對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米抗蟲(chóng)蛋白和原核表達(dá)的抗蟲(chóng)蛋白進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,原核表達(dá)得到了大小約為65 kD的蛋白并且將該蛋白進(jìn)行了純化。以純化蛋白、轉(zhuǎn)基因玉米蛋白和原核表達(dá)蛋白進(jìn)行了Western blot檢測(cè),在免疫原性上植物蛋白和原核表達(dá)蛋白具有一致性,經(jīng)過(guò)質(zhì)譜分析得知,兩種蛋白在氨基酸組成上也具有一致性。對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米進(jìn)行田間耐除草劑和抗蟲(chóng)性試驗(yàn)、非靶標(biāo)除草劑試驗(yàn)、栽培地生存競(jìng)爭(zhēng)力試驗(yàn)、荒地競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)、產(chǎn)量測(cè)定和發(fā)芽率檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果表明,吉抗309對(duì)亞洲玉米螟有高抗蟲(chóng)性,能耐受6倍除草劑并且與對(duì)應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因玉米、本地主栽品種之間無(wú)生存競(jìng)爭(zhēng);轉(zhuǎn)基因玉米在水分和養(yǎng)分相對(duì)于雜草無(wú)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì),因此判斷轉(zhuǎn)基因玉米不會(huì)演變成雜草,發(fā)芽率和非轉(zhuǎn)基因玉米無(wú)明顯差異。分析了轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米的脂肪酸構(gòu)成、氨基酸組成和礦質(zhì)元素的含量,結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米在營(yíng)養(yǎng)成分含量上無(wú)明顯差異。上述研究表明,轉(zhuǎn)基因玉米具有遺傳穩(wěn)定性,和非轉(zhuǎn)基因玉米在田間不存在競(jìng)爭(zhēng),和雜草無(wú)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì),產(chǎn)量和發(fā)芽率都和非轉(zhuǎn)基因玉米無(wú)明顯差異。因此,吉抗309轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)于環(huán)境是安全的。營(yíng)養(yǎng)成分分析結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米之間在營(yíng)養(yǎng)成分的種類(lèi)和含量上不存在差異。這些結(jié)果對(duì)于轉(zhuǎn)基因玉米的環(huán)境安全評(píng)價(jià)也提供了保障,也為轉(zhuǎn)基因玉米吉抗309的食品安全評(píng)價(jià)提供了理論依據(jù)。
【圖文】：

AB圖2-1 轉(zhuǎn)基因玉米吉抗309的PCR檢測(cè)結(jié)果圖 2-1A：cryNGc PCR 檢測(cè)結(jié)果，圖 2-1 B：bar PCR 檢測(cè)結(jié)果。M：DL2000 Marker；1：陽(yáng)性對(duì)照；2：陰性對(duì)照；3：空白對(duì)照；4-13：吉抗 309 轉(zhuǎn)基因植株。Fig.2-1 PCR detection results of transgenic plants JiKang 309A：cryNGc gene B：bar geneM：DL2000 Marker；1：positive control；2：negative control；3：blank control；4-11：transgenicplants of JiKang 309用 SDS 法提取轉(zhuǎn)基因玉米吉抗 309 葉片和非轉(zhuǎn)基因玉米吉 853 的總 DNA。以cryNGc 質(zhì)粒作陽(yáng)性對(duì)照，，非轉(zhuǎn)基因玉米作為陰性對(duì)照，水作為空白對(duì)照，分別以

因植株體內(nèi)都能成功轉(zhuǎn)錄。A B圖2-2 轉(zhuǎn)基因玉米吉抗309的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果圖2-2 A：cryNGc基因；圖2-2 B：bar基因1：非轉(zhuǎn)基因玉米；2-6：轉(zhuǎn)基因玉米Fig.2-2 RT-PCR detection results of transgenic plants JiKang 309A：RT-PCR detection results of cryNGc，B： RT-PCR detection results of bar1：Non-GMO maize；2-6：GMO maize2.5.3 轉(zhuǎn)基因玉米蛋白的試紙條檢測(cè)結(jié)果以 bar 試紙條（圖 3-2A）和 cry1Ab 試紙條（圖 3-2B）對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米吉抗 309的葉片進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因陰性植株只有質(zhì)控線而無(wú)檢測(cè)線，但是轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株都出現(xiàn)了檢測(cè)線，這證明在轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)表達(dá)了抗蟲(chóng)蛋白和耐除草劑蛋白。
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S513

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本文編號(hào)：2654335