【摘要】：目的:觀察EPCR基因敲低的人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)對博來霉素所致小鼠肺纖維化的治療作用,初步探索其可能的機制。方法:根據(jù)EPCR基因mRNA序列,合成3條小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)導(dǎo)入hUC-MSCs,通過檢測EPCR蛋白表達,篩選干擾效果最佳si RNA。根據(jù)最佳siRNA序列構(gòu)建慢病毒載體,包裝重組慢病毒,感染h UC-MSCs,Real-time PCR和Western blot驗證敲低效率。將C57BL/6小鼠隨機分為5組:空白對照組(Ctrl)、模型對照組(B)、干細胞治療組(B+MSCs)、敲低組干細胞治療組(B+shRNA-EPCR-MSCs)、陰性對照組干細胞治療組(B+shRNA-NC-MSCs)。小鼠10%水合氯醛腹腔麻醉,無創(chuàng)氣管插管法分別給予空白對照組生理鹽水50μL,其余組給予同等體積博來霉素3mg/kg。建模后第7天,干細胞治療組、敲低組干細胞治療組、陰性對照組干細胞治療組經(jīng)氣管插管給予各自對應(yīng)細胞懸液5*10~5/50ul/只,空白對照組和模型對照組給予等量無菌生理鹽水。造模后第21天處死小鼠并收集肺組織標本,進行HE和Masson染色,Ashcroft評分,Sircol法檢測肺內(nèi)可溶膠原量,以評定不同分組小鼠肺纖維化程度。最后體外構(gòu)建轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor beta1,TGF-β1)誘導(dǎo)干細胞向成纖維細胞分化模型,分別誘導(dǎo)敲低組和陰性對照組干細胞,Real-time PCR和Western blot檢測α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和Ⅰ型膠原(type I collagen,ColⅠ)在誘導(dǎo)前后表達水平,以反映分化程度。結(jié)果:以EPCR最佳siRNA序列構(gòu)建EPCR基因RNAi慢病毒載體,成功減低hUC-MSCs內(nèi)EPCR的mRNA(P0.001)和蛋白(P0.001)表達。B+shRNA-EPCR-MSCs組小鼠較模型對照組中位生存時間明顯延長(P0.05),肺部病理改變較輕,Ashcroft評分較低(P0.05),肺內(nèi)膠原沉積較少(P0.05)。敲低組干細胞合成的ColⅠ在mRNA和蛋白水平(P0.05)均減少。體外TGF-β1誘導(dǎo)可增加hUC-MSCs內(nèi)α-SMA、ColⅠ的表達(mRNA水平,P0.05;蛋白水平,P0.05),促進其向成纖維細胞分化。敲低EPCR可部分抑制TGF-β1所致α-SMA及ColⅠ表達增多(mRNA水平,P0.05;蛋白水平,P0.05)。結(jié)論:shRNA-EPCR-MSCs可以改善博來霉素所致小鼠肺纖維化,可能與敲低EPCR減少hUC-MSCs內(nèi)ColⅠ表達,并減弱其向成纖維細胞分化有關(guān)。
【圖文】：

圖 1.1 siRNAs 轉(zhuǎn)入 hUC-MSCs 后 EPCR 蛋白表達的檢測1.1 Detection of the protein expression of EPCR after transfection of hUC-MSCs by siRNAs（注：A.EPCR 蛋白表達；B.EPCR 蛋白表達的量化分析a：與對照組比較，P＜0.001；b：與 siRNA-2 比較，，P＜0.001）

序列分析
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R575.2

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 梁艷;李濤;周克元;;慢病毒載體在RNA干擾中的應(yīng)用進展[J];國際檢驗醫(yī)學雜志;2010年11期

本文編號：2652888