【摘要】：二硫吡咯酮類化合物具有獨特的二硫吡咯酮環(huán)結(jié)構(gòu)。還原型的二硫吡咯酮類化合物能夠螯合細胞內(nèi)Zn~(2+)依賴酶的金屬離子,從而影響細胞內(nèi)泛素化進程以及RNA的轉(zhuǎn)錄,對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌以及腫瘤細胞都表現(xiàn)出較強的抑制活性。目前,關于二硫吡咯酮類化合物生物合成的研究報道還比較少,僅有holomycin的生物合成途徑被部分解析。與holomycin類二硫吡咯酮化合物不同,thiolutin類化合物在二硫吡咯酮環(huán)的N_4位上多了一個甲基,導致其抑制真菌和腫瘤細胞的活性更強。因此,研究thiolutin類二硫吡咯酮化合物的生物合成基因簇,解析此類化合物的生物合成機制具有重要的研究意義。前期研究從產(chǎn)thiolutin和aureothricin的鏈霉菌Streptomyces thioluteus DMS40027中發(fā)現(xiàn)一個二硫吡咯酮類化合物的生物合成基因簇aut,可在白色鏈霉菌中異源表達產(chǎn)生N_4位上缺少甲基化修飾的二硫吡咯酮類化合物holomycin和N-propionylholothine。為了探究aut基因簇中各基因的功能,本研究對可能的結(jié)構(gòu)基因、氧化還原酶基因、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因分別進行了基因敲除實驗。發(fā)現(xiàn)硫酯酶基因autC、非核糖體多肽合成酶基因autE、脫羧酶基因autF以及硫氧還原蛋白氧化還原酶基因autI敲除后,異源表達產(chǎn)物holomycin和N-propionylholothine無法合成,證明這4個基因為aut基因簇生物合成必須的結(jié)構(gòu)基因。在前期已鑒定的兩個二硫吡咯酮類化合物的生物合成基因簇thi和hlm中也發(fā)現(xiàn)了這4種結(jié)構(gòu)基因的存在,但三個基因簇的異源表達產(chǎn)物所包含的側(cè)鏈基團卻不盡相同。為了探究位于不同基因簇的同源基因在功能上是否存在差異,我們在進行基因回補實驗的同時,也嘗試使用來自其它基因簇的同源基因互補缺失基因的功能。發(fā)現(xiàn)硫酯酶基因hlmC和thiC可以代替autC發(fā)揮功能,將NRPS催化生成的中間產(chǎn)物從T domain上水解下來。脫羧酶基因hlmF和thiF可以代替autF發(fā)揮作用,將兩個半胱氨酸縮合物的羧基水解下來。這些同源基因的功能相同。�；D(zhuǎn)移酶能夠?qū)⒉煌N類的�；D(zhuǎn)移到二硫吡咯酮環(huán)的N_7位,從而產(chǎn)生多種二硫吡咯酮類化合物。�；D(zhuǎn)移酶基因autA敲除后,異源表達產(chǎn)物holomycin產(chǎn)量降低,而N-propionylholothine消失。除了autA基因能夠回補自身的缺失,從而恢復兩種異源表達產(chǎn)物的合成以外,同源基因thiA1和thiA2無法互補autA的功能,而hlmA的互補只是恢復了holomycin的產(chǎn)量,而無法產(chǎn)生N-propionylholothine。這些結(jié)果表明4個�；D(zhuǎn)移酶的底物特異性存在著差異。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)AutA比HlmA多出了一個PLP依賴的裂解酶結(jié)構(gòu)域,暗示著AutA可能具有額外的功能。NRPS是二硫吡咯酮類化合物生物合成中最為關鍵的核心酶,催化兩個半胱氨酸底物縮合形成二硫吡咯酮環(huán)的骨架。NRPS基因thiE可以替代autE,恢復autE基因缺失突變菌株中二硫吡咯酮類化合物的合成,而來自hlm基因簇的同源基因hlmE則不能。暗示著HlmE與ThiE和AutE在功能上存在差異。thi和aut基因簇是從產(chǎn)生thiolutin類型的菌株中鑒定得到的,而hlm則是來自于產(chǎn)生holomycin的菌株。NRPS基因功能的差異暗示著thiolutin類和holomycin類二硫吡咯酮環(huán)的合成途徑可能并不完全相同。此外還發(fā)現(xiàn)敲除氧化還原酶基因orf8和orf9,不僅沒有妨礙holomycin和N-propionylholothine的合成,反而促使其產(chǎn)量明顯提高。而編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的基因orf1、orf3、orf4和orf5的敲除沒有影響holomycin和N-propionylholothine的產(chǎn)生,說明它們未參與到異源表達產(chǎn)物的合成途徑中。
【圖文】：

[4]。此外，近幾年來還發(fā)現(xiàn)二硫吡咯酮類化合物具有抗腫瘤的活性。二硫吡咯酮類化合物因為具有獨特的二硫吡咯酮環(huán)結(jié)構(gòu)（圖1.2.1），所以在389nm波長下表現(xiàn)出強烈的紫外吸收。依據(jù)側(cè)鏈基團的不同，這類化合物可分為三類：N4-甲基化-N7-�；量┩椋╰hiolutin類型），N7-�；量┩椋╤olomycin類型）和一類特殊的有機酸加載在DTP結(jié)構(gòu)上的thiomarinol。圖1.2.1 二硫吡咯酮類化合物的化學結(jié)構(gòu)Fig. 1.2.1 Structures of isolated dithiolopyrrolones早期的研究普遍認為二硫吡咯酮類化合物的作用靶點是細菌的RNA聚合酶，而最近的一些研究證實這類化合物在真核細胞中的靶點并不是II型RNA聚合酶，而是泛素-蛋白酶體系統(tǒng)。還原性thiolutin能夠抑制包含JAMM結(jié)構(gòu)域的金屬蛋白酶Rpn11，

氨酸脫水縮合形成吡咯酮環(huán)，再在側(cè)鏈上添加活化的有機酸從而形成二硫吡咯酮類化合物。圖1.4.1 假定的二硫吡咯酮類化合物的生物合成途徑[17]Fig.1.4.1 Proposed dithiolopyrrolone biosynthetic pathway[17]1.4.1 生物合成基因簇的鑒定然而隨著近幾年來分子生物學的發(fā)展、全基因組測序技術(shù)的普及以及生物信息學的進步，許多研究者從土壤鏈霉菌以及海洋微生物中都陸續(xù)克隆到了二硫吡咯酮類化合物的生物合成基因簇。2010年，Li等對產(chǎn)生菌S. clavuligerus基因組序列進行生物信息學分析，找到了一個可能負責holomycin生物合成的基因簇，并且對holomycin的生物合成途徑進行了
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：Q78

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本文編號：2652149