【摘要】：中國(guó)水仙(Narcissus tazetta var.chinensis)是我國(guó)十大傳統(tǒng)名花,觀賞價(jià)值較高。然而水仙花色單調(diào)、品種單一,至今中國(guó)水仙品種仍較少。深入研究中國(guó)水仙花色形成的分子機(jī)制,進(jìn)行分子改造,將是中國(guó)水仙花色創(chuàng)新和新品種培育的有效途徑。本研究以漳州水仙為材料,通過(guò)水仙花瓣和副冠轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,篩選出參與調(diào)控類(lèi)黃酮合成途徑的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子,進(jìn)行表達(dá)分析及功能驗(yàn)證,為中國(guó)水仙花色形成機(jī)理的研究提供理論基礎(chǔ)。本研究主要獲得以下研究成果:1.本試驗(yàn)以漳州水仙'金盞銀臺(tái)'為實(shí)驗(yàn)材料,提取始花期花朵(花瓣和副冠混合)RNA,用IlluminaHiseq 2000進(jìn)行高通量測(cè)序,共獲得 23,081,029 條total clean reads,組裝后共獲得 55,418 條 unigene,其中超過(guò)500的unigene有21,750個(gè),長(zhǎng)度在1kb以上的unigene有11,053 條,unigene 平均讀長(zhǎng) 669bp,N50 讀長(zhǎng) 1,049bp。對(duì) Unigene進(jìn)行功能注釋,包括與 NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、GO和Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì),共獲得32,414條Unigene的注釋結(jié)果,從而構(gòu)建了水仙花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)。進(jìn)行基于Unigene庫(kù)的基因結(jié)構(gòu)分析,其中SSR分析共獲得3,276個(gè)SSR標(biāo)記。將花轉(zhuǎn)錄組與之前測(cè)序的鱗莖盤(pán)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析,共得到7,059個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs),其中3,663個(gè)DEGs上調(diào)表達(dá),3,396個(gè)DEGs下調(diào)表達(dá),差異表達(dá)基因被注釋到126個(gè)KEGG代謝通路。2.通過(guò)花轉(zhuǎn)錄組與鱗莖盤(pán)轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因分析,獲得2個(gè)與類(lèi)黃酮代謝相關(guān)的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子。初步序列分析表明其中一個(gè)與花青素合成抑制有關(guān),命名為NtMYB7;另一個(gè)與類(lèi)黃酮合成激活有關(guān),命名為NtMYB8。3.從漳州水仙中克隆出NtMYB7和NtMYB8編碼區(qū)全長(zhǎng)序列,開(kāi)放閱讀框(ORF)分別為753bp、803bp,分別編碼250和268個(gè)氨基酸。NtMYB7和NtMYB8的GenBank登錄號(hào)為MF522208和MF522209。蛋白多重序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)NtMYB7、NtMYB8基因都含有R2和R3保守結(jié)構(gòu)域,屬于R2R3-MYB基因;系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示NtMYB7與花青素合成抑制因子聚為一類(lèi),NtMYB8與花青素合成激活因子聚為一類(lèi)。通過(guò)對(duì)NtMYB7、NtMYB8在中國(guó)水仙不同花期花瓣和副冠以及不同器官的表達(dá),發(fā)現(xiàn)NtMYB7表達(dá)量在鱗莖盤(pán)中表達(dá)量最高,表達(dá)量是花苞期花瓣表達(dá)量的近20倍;在花瓣中,NtMYB7基因的相對(duì)表達(dá)量隨著水仙花的開(kāi)放逐漸升高,盛花期達(dá)到最高;在副冠中,始花期表達(dá)量最高,花苞期和盛花期表達(dá)量較低。NtMYB8在花中的表達(dá)量高于鱗莖盤(pán)和葉片,花苞期副冠中NtMYB8的表達(dá)量是鱗莖盤(pán)的近17倍,隨著花的開(kāi)放,NtMYB8在副冠中的表達(dá)量顯著下降。4.構(gòu)建 pSAK277-NtMYB7 和 pSAK277-NtMYB8 植物表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌,進(jìn)行煙草瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。在煙草瞬時(shí)表達(dá)中,定量PCR分析表明NtMYB7顯著抑制煙草黃酮醇代謝分支FLS基因的表達(dá),同時(shí)抑制StMYB激活的花青素和原花青素合成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。研究結(jié)果初步判斷NtMYB7是中國(guó)水仙類(lèi)黃酮代謝途徑的抑制因子。單獨(dú)注射N(xiāo)tMYB8基因煙草葉片沒(méi)有變化,NtMYB8基因與StBHLH混合注射,定量結(jié)果顯著上調(diào)FLS、LAR和ANS基因的表達(dá),NtMYB8可能與StBHLH結(jié)合促進(jìn)黃酮醇、原花青素以及花青素的合成。但是NtMYB8在水仙的花中表達(dá)量最高,所以推測(cè)它在中國(guó)水仙中,特別是副冠中可能同時(shí)激活黃酮醇、原花青素和花青素的合成,但是由于水仙與煙草不同,在水仙中是否激活黃酮醇代謝途徑,還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。5.通過(guò)NtMYB7基因、NtMYB8基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)化煙草,獲得了轉(zhuǎn)基因植株,煙草開(kāi)花表型分析發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因花色顏色變淺,進(jìn)一步推測(cè)NtMYB7基因可能抑制了花青素代謝途徑,導(dǎo)致顏色變淺;NtMYB8基因可能主要促進(jìn)黃酮醇分支,從而與花青素分支競(jìng)爭(zhēng),導(dǎo)致煙草花色變淺,其基因功能需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。
【圖文】：

（４）鞋酐（Ｐｈｌｏｂａｐｈｅｎｅｓ）途徑；（５）原花青素（Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙｎｉｄｉｎｓ）途徑；（６）花逡逑青素（Ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ）途徑；（７）橙酮（Ａｕｒｏｎｅｓ）途徑［１７］。逡逑類(lèi)黃酮合成途徑如圖１－１，類(lèi)黃酮色素的前體物質(zhì)是苯丙氨（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ），逡逑其合成途徑由多種結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因控制。首先，類(lèi)黃酮代謝途徑為由苯丙氨逡逑酸裂解酶（ＰＡＯ催化苯丙氨酸形成肉桂酸，再經(jīng)肉桂酸徑化酶（Ｃ份）和香豆逡逑酞ＣｏＡ連接酶ＵＣＺ）的催化作用形成４－香豆素－ＣｏＡ，接著在查兒酮合成酶逡逑Ｃ／對(duì)（Ｃｈａｌｃｏｎｅ邋ｓｙｎｔｈａｓｅ）的作用下生成查兒酮；其中香豆酰ＣｏＡ來(lái)源于苯丙煉逡逑途徑（Ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄ邋ｐａｔｈｗａｙ），丙二酰ＣｏＡ來(lái)自乙憸ＣｏＡ［１８］；接著，以查爾逡逑酮為底物并在查耳酮異構(gòu)酶Ｃ７／／（Ｃｈａｌｃｏｎｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ）的作用下生成黃酮；之后黃逡逑酮在黃酮醇－３－輕化酶（Ｆａｖｏｎｏ３－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ邋）和黃酮醇－３’－輕化酶逡逑’／／（Ｆｌａｖｏｎｏｌ邋３’－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）的作用下形成二氫黃酮醇，在二氫黃酮醇４－還原酶逡逑ｉ＾Ｐ＾Ｄｉｈｙｄｒｏｆｌａｖｏｎｏｌ邋４－ｒｅｄｕｃｔａｓｅ邋）和黃酮醇合成酶邋ＦＬＳ（Ｆｌａｖｏｎｏｌ邋ｓｙｎｔｈａｓｅ）作用下逡逑生二氫黃酮醇分別生成花青素和黃酮醇；原花青素原花青素還原酶逡逑Ｕｉ？（Ｌｅｕｃｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ邋ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）的催化作用下生成兒茶素，花青素在花青素還逡逑原酶邐Ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ邋ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）催化下形成表兒茶素［

。分析，我們能在宏觀水平上檢測(cè)物種轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)和表達(dá)量。本部分實(shí)驗(yàn)主要以逡逑水仙始花期的花朵為實(shí)驗(yàn)材料，基于Ｉｌｌｕｍｉｎａ邋ＨｉＳｅｑＴＭ邋２０００進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組高通量逡逑測(cè)序。前期研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)水仙花中黃酮類(lèi)物質(zhì)主要是黃酮醇，淲莖盤(pán)中主要黃逡逑酮類(lèi)物質(zhì)是原花青素％因此本研宄將花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與前期獲得的淲莖盤(pán)轉(zhuǎn)錄組逡逑數(shù)據(jù)對(duì)比分析，，篩選出類(lèi)黃酮合成途徑參與調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，逡逑為進(jìn)一步分析水仙類(lèi)黃酮代謝途徑的調(diào)控機(jī)制和中國(guó)水仙花色研究奠定基礎(chǔ)。逡逑１實(shí)驗(yàn)材料逡逑１．１植物材料逡逑以漳州水仙‘金盞銀臺(tái)’（白色花瓣和黃色副冠）為實(shí)驗(yàn)材料，水仙的成花過(guò)逡逑程分為３個(gè)時(shí)期，轉(zhuǎn)錄測(cè)序以水仙始花期的花朵為實(shí)驗(yàn)材料。取水仙種球，剝?nèi)ュ义献钔鈱喻[片，放入水中培養(yǎng)至開(kāi)花后，取始花期的花瓣和副冠（去掉花絲、花藥逡逑和花柱）混合后置于離心管中，用液氮速凍，立即放入－８０°Ｃ冰箱中貯存?zhèn)溆�。逡�?
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：Q943.2;S682.21

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 曾黎輝;羅鵬;吳雪琴;;類(lèi)黃酮合成途徑結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)分析與中國(guó)水仙不能合成花青素原因的初步解析[J];農(nóng)業(yè)科技與信息(現(xiàn)代園林);2015年04期

2 趙佳;劉榮;楊帆;李鑫;劉厚生;嚴(yán)倩;肖月華;;月季花青素苷相關(guān)R_2R_3-MYB蛋白基因的克隆和表達(dá)分析[J];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué);2015年07期

3 邢文;金曉玲;;調(diào)控植物類(lèi)黃酮生物合成的MYB轉(zhuǎn)錄因子研究進(jìn)展[J];分子植物育種;2015年03期

4 楊琳;王宇;楊劍飛;李玉花;;花青素積累相關(guān)負(fù)調(diào)控因子的研究進(jìn)展[J];園藝學(xué)報(bào);2014年09期

5 周翔;馮瑩;潘東明;;中國(guó)水仙遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展(綜述)[J];亞熱帶植物科學(xué);2013年04期

6 李錫花;吳Z

本文編號(hào)：2645497