【摘要】：抗黏液病毒(Myxovirus resistance,Mx)基因是在干擾素(Interferon,IFN)誘導下產(chǎn)生的具有抗病毒活性的因子,在生物界廣泛存在。Mx基因編碼的蛋白,其抗病毒作用的發(fā)揮與其典型的結構密切相關。在魚類中,也存在多種Mx基因,并在魚類天然免疫應答中發(fā)揮著不同程度的抗病毒作用。因此,本研究利用RACE技術克隆了赤眼鱒Mx基因亞型(ScMx1),并利用熒光定量PCR技術,對ScMx1和ScIFN-I在GCRV感染條件下的表達特征進行了探究。此外,使用本團隊劉敏構建的含赤眼鱒Mx基因(ScMx)的重組質粒ScMxORF-pTgf2-L-R,結合Tgf2高效轉座系統(tǒng),在草魚中初步開展了轉基因研究。本研究獲得的主要結果如下:(1)ScMx1基因的cDNA克隆及序列分析結果ScMx1的cDNA全長為3 000bp,包括5′非編碼區(qū)124 bp,3′非編碼區(qū)983 bp,開放閱讀框為1 893 bp,編碼630個氨基酸。ScMx1基因編碼的蛋白結構具有脊椎動物Mx蛋白的共同特征,在N端的GTP酶結構域(含一個三聯(lián)體GTP結合區(qū)域和一個動力蛋白信號),中間結構域和C端的GTP酶效應結構域(含亮氨酸拉鏈區(qū)域)。ScMx1與其他物種的相似性比較發(fā)現(xiàn),ScMx1與青魚bcMx1、草魚CiMx1和CiMx3的相似性較高,分別為97%、95%和97%;而ScMx1與ScMx、CiMx2、鯽魚Mx2等魚類的相似性較低,只有49%~50%。通過構建系統(tǒng)進化樹表明,ScMx1與bcMx、CiMx3、CiMx1等鯉科魚類進化關系較近,與ScMx、CiMx2等鯉科魚類進化關系較遠。為進一步研究ScMx1以及ScMx的抗病毒功能奠定了理論基礎。(2)ScMx1基因的表達分析結果ScMx1在赤眼鱒鰓、肝臟、脾臟、體腎、頭腎、腦、皮膚、肌肉、腸和心臟共10個組織中均能夠檢測到,其中,ScMx1在脾臟中的表達量最高,其次是心臟,在腸和肝臟中的表達量相對較低。人工感染GCRV后(6 h,12 h,24 h,72 h,168 h),ScMx1與ScIFN-I在所檢測的肝臟、脾臟、體腎和頭腎4個組織中的表達量與對照組相比,均顯著上調;但不同的組織,ScMx基因和ScIFN-I基因具有不同的表達特征。在肝臟和體腎中,ScMx1持續(xù)上調至168 h,而ScIFN-I在72h時達到峰值。在脾臟和頭腎中,ScMx1和ScIFN-I均在72 h時出現(xiàn)峰值。總之,ScMx1基因參與了赤眼鱒抵抗GCRV的免疫應答反應。(3)轉ScMx基因在草魚中的初步研究結果采用顯微注射法將重組質粒ScMxORF-pTgf2-L-R和輔助質粒pCS2-CMV-gfTP導入草魚受精卵中,共注射約6 000粒卵;經(jīng)過胚胎培養(yǎng)6個月,統(tǒng)計得到6月齡的轉基因草魚共206尾,計算存活率為3.4%。進一步對存活的全樣本進行PCR檢測,得到陽性整合率為37.9%,最終篩選出一批轉ScMx基因草魚陽性群體。為轉基因草魚的抗病育種工作奠定了基礎。
【學位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S917.4

【參考文獻】

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