【摘要】：作物馴化是將野生種馴化為能夠適應(yīng)栽培環(huán)境并滿足人類需求的過程。在馴化過程中,作物的植株形態(tài)、籽粒大小以及種子落粒性等性狀均發(fā)生了顯著變化。其中,落粒性的喪失是禾本科作物馴化的關(guān)鍵一步。落粒性馴化關(guān)鍵基因的分離鑒定及分子進(jìn)化研究將有助于探索作物的起源與演化。本研究采用圖位克隆策略克隆了一個(gè)非洲稻落粒性馴化的關(guān)鍵基因,并對(duì)其進(jìn)化進(jìn)行了分析,主要研究結(jié)果如下:1.利用非洲野生稻(Oryza barthii A.Chev.)W1411 和非洲栽培稻(Oryza glaberrima Steud.)IRGC104165構(gòu)建的分離群體,在第三染色體定位到一個(gè)落粒性基因ObSH3(Oryza barthii Seed Shattering3),進(jìn)一步利用次級(jí)分離群體和新開發(fā)的分子標(biāo)記最終將ObSH3基因定位在分子標(biāo)記SNP29和SNP31之間。這兩個(gè)分子標(biāo)記之間的物理距離在非洲栽培稻IRGC104165基因組中為17-kb,而在非洲野生稻W(wǎng)1411基因組中為63-kb。與非洲栽培稻IRGC104165相比,該區(qū)間有一個(gè)大小為45.5-kb的插入片段,該定位區(qū)間預(yù)測(cè)有6個(gè)基因,分別命名為ORF1-ORF6。RT-qPCR分析表明,在這6個(gè)基因中只有ORF3基因在離層區(qū)域高豐度表達(dá),因此將該基因作為ObSH3的候選基因。2.利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)W1411的ORF3基因進(jìn)行敲除,在T1代轉(zhuǎn)基因植株中,分別獲得了 1-bp插入、5-bp缺失以及19-bp缺失等三種不同類型的純合突變株系。這三種類型的轉(zhuǎn)基因株系均表現(xiàn)為不落粒,該結(jié)果表明ORF3就是控制非洲野生稻落粒性狀的ObSH3基因。同時(shí),我們構(gòu)建了該基因的基因組互補(bǔ)載體、超表達(dá)載體以及RNAi載體,這些載體的轉(zhuǎn)基因研究結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了 ORF3就是ObSH3基因。3.RT-qPCR分析表明,ObSH3基因主要在小穗離層、葉片、莖等部位表達(dá)。GUS染色結(jié)果與RT-qPCR結(jié)果基本一致。mRNA原位雜交分析表明,ObSH3在小穗的離層部位具有強(qiáng)烈的表達(dá)。以上這些結(jié)果表明,ObSH3的表達(dá)模式與其調(diào)控離層的形成與發(fā)育這一功能相一致。4.ObSH3是一個(gè)YABBY家族的轉(zhuǎn)錄因子,亞細(xì)胞定位結(jié)果表明ObSH3定位在細(xì)胞核上,這與該基因被預(yù)測(cè)為轉(zhuǎn)錄因子這一結(jié)果是一致的。氨基酸序列分析表明ObSH3編碼蛋白的鋅指結(jié)構(gòu)域以及YABBY結(jié)構(gòu)域在單子葉植物中是高度保守的。5.通過對(duì)91份非洲栽培稻中SH3基因和GL4/SH4基因(位于4號(hào)染色體上控制落粒的基因)的基因型以及地理分布進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),有11份非洲栽培稻僅含有SH3缺失變異,有51份僅含有SH4變異,剩余的29份同時(shí)含有這兩個(gè)基因變異。這表明在非洲栽培稻馴化過程中,SH3缺失變異受到了強(qiáng)烈的選擇。由于這11份只包含SH3缺失變異的非洲栽培稻均集中位于非洲西部的幾內(nèi)亞、塞拉利昂和利比里亞等地區(qū),據(jù)此推測(cè)這一區(qū)域可能是SH3變異的起源地。ObSH3的分離鑒定不僅闡明了水稻離層發(fā)育的分子機(jī)制,同時(shí)也為非洲栽培稻的馴化過程提供了新的分子證據(jù)。
【圖文】：

。ｍｇａｓｅｍ３７°0５１１１丨１１，并重復(fù)。轉(zhuǎn)入０．２）＜８５（：中，５５°（：１１１。轉(zhuǎn)入�。福持校瑪[放在托盤內(nèi)，加入Ｒｏｃｈｅ／Ｔｒｉｔｏｎ溶液以及ＢＳＡ／Ｔｒｉｔｏｎ溶液，轉(zhuǎn)入含有ＢＳＡ溶液中，置于室溫?fù)u床４５邋ｍｉｎ。滴加抗體溶液片，室溫下?lián)u床上Ｗ邋ＢＳＡ／邋ｔｒｉｔｏｎ液體震蕩漂洗４次。轉(zhuǎn)入Ｂｕｆｆ色底物溶液，置于考普林杯中顯色２？３邋ｄ。逡逑將樣品玻片在ＴＥ溶液中漂洗２次，乙醇梯度脫水處理，再加拿大樹膠封片，，晾干后即可觀察。逡逑建逡逑基因編輯載體構(gòu)建逡逑稻Ｗ１４１１的基因ｃＤＮＡ序列非保守區(qū)域設(shè)計(jì)四個(gè)靶加入價(jià)ａｌ酶切位點(diǎn)），以ｓｇＲＮＡ骨架＋ＯｓＵ３啟動(dòng)子為模板ｐＳ奶進(jìn)行酶切，將ＰＣＲ擴(kuò)增片段與酶切載體片段稻Ｗ１４１１的基因靶序列的基因編輯載體，經(jīng)測(cè)序成功ｉ２－ＯｂＳＨ３邋0逡逑；？＇■邋０0？逡逑■邋０ｒｖｊ？ｒ邋？＇逡逑

論文邐互補(bǔ)載體構(gòu)建逡逑Ｗ１４１１為參考序列設(shè)計(jì)引物，并分別在引物上加入母《邋Ｉ得到包含基因起始密碼子ＡＴＧ前約２．３－ｋｂ以及終為１２－ｋｂ的互補(bǔ)片段，對(duì)ＰＣＲ產(chǎn)物進(jìn)行純化回收；用體進(jìn)行酶切，回收純化后將兩個(gè)回收產(chǎn)物混合進(jìn)行重組連載體上，得到含有非洲野生稻Ｗ１４１丨的ＯＭ／／３名為ｐＯＭＺ／３。逡逑Ｓ．ＡＫｌｆｌ）逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S511.9

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2637167