【摘要】：假眼小綠葉蟬Empoasca vitis(G(?)the)廣泛分布于我國各個茶區(qū),是最重要的茶葉害蟲之一。該蟲防治困難,主要依靠化學農(nóng)藥防治,導(dǎo)致了嚴重的“3R”問題,因此迫切需要尋找其它防治方法。昆蟲海藻糖酶是滯育激素調(diào)節(jié)與幾丁質(zhì)合成過程中的關(guān)鍵酶,對昆蟲生長發(fā)育具有重要意義。本研究利用RACE技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù),不僅克隆得到了假眼小綠葉蟬海藻糖酶基因,明確了其表達情況,同時為防控葉蟬提供了新的思路,為最終發(fā)展持續(xù)控制害蟲的新技術(shù)奠定基礎(chǔ)。本論文的主要內(nèi)容及結(jié)果如下:(1).假眼小綠葉蟬內(nèi)參基因的篩選在假眼小綠葉蟬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選了5種內(nèi)參基因(18S,ACT,EF1α,RPL10,α-TuB)設(shè)計其特異性引物,運用熒光定量PCR技術(shù)檢測不同處理(不同發(fā)育階段、低溫脅迫處理、饑餓脅迫處理、不同農(nóng)藥濃度處理)下的假眼小綠葉蟬5個內(nèi)參基因的穩(wěn)定性,并使用geNorm、NormFinder、Bestkeeper、ΔCt法以及RefFinder軟件對內(nèi)參基因的可靠性進行分析。結(jié)果表明,在不同發(fā)育階段下,RPL10和EF1α的穩(wěn)定性最好;在農(nóng)藥脅迫下,18S和ACT是最好的內(nèi)參基因組合;在饑餓脅迫下,EF1α和RPL10是表達最穩(wěn)定的兩個基因;在低溫脅迫處理下,RPL10和EF1α是穩(wěn)定性最好的基因。(2).假眼小綠葉蟬海藻糖酶基因的克隆與分析通過RACE技術(shù)獲得海藻糖酶基因cDNA全長為2469 bp,其中包含開放閱讀框ORF 1797 bp,一共編碼氨基酸642個,起始密碼子和終止密碼子分別為ATG、TAG。序列中含有海藻糖酶基因的經(jīng)典標簽序列“PGGRFREFYYWDSY”和“QWDYPNAWPP”以及一個甘氨酸富集區(qū)“GGGGEY”。預(yù)測編碼蛋白分子量為74185.44,理論等電點為5.80,不穩(wěn)定系數(shù)為38.91,分子式為C_(3361)H_(5091)N_(869)O_(972)S_(30),脂肪總數(shù)為77.59,總平均親水性-0.381。該氨基酸序列和已經(jīng)公布的其他昆蟲海藻糖酶基因有很高的相似性。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)該基因預(yù)測存在兩個得分較高的跨膜區(qū),因此該海藻糖酶基因為膜結(jié)合型海藻糖酶,并將其命名為EvTre2。(3).假眼小綠葉蟬海藻糖酶基因在不同處理下的表達分析海藻糖酶基因在不同處理下均有所表達。且在低溫脅迫處理下,各個低溫處理下的海藻糖酶基因表達較未處理成蟲相比均有所提高,在4℃處理一小時的樣品中表達量達到最高。在農(nóng)藥處理脅迫中,經(jīng)三個農(nóng)藥濃度處理的樣品的海藻糖酶基因表達量均有所提高,并且在濃度3000 mL/公頃時達到了最高。在不同發(fā)育階段下,若蟲的表達情況較成蟲有所下降。在饑餓脅迫處理下,各個時長饑餓處理均有所提高,特別在饑餓60 h的樣品中表達量大幅提高。結(jié)果顯示EvTre2與假眼小綠葉蟬的抗逆性機制有著極為密切的關(guān)系。綜上所述,本研究首次成功地從假眼小綠葉蟬中克隆得到膜結(jié)合型海藻糖酶基因,并對其進行了生物信息學分析以及表達分析,為進一步深入研究海藻糖基因在假眼小綠葉蟬中的的作用奠定基礎(chǔ),為防治假眼小綠葉蟬提供了新的思路。
【圖文】：

軟件對 5 對內(nèi)參基因進行篩選，擴增獲得 E. vitis 海藻糖酶基因?qū)π蛄羞M行生物信息學分析。 對假眼小綠葉蟬在不同發(fā)育階段酶基因進行表達分析，以驗證假術(shù)路線如圖 1.1。杭州茶區(qū)假眼小綠葉蟬樣本的采集提取不同處理下的假眼

23 RNA 瓊脂糖凝膠電泳圖 (M：DL2000 mark帶)l electrophoresis of Empoasca vitis’RNA(M：DL2 ：RNA)條內(nèi)參基因的克隆小綠葉蟬 cDNA 為模板,經(jīng) 5 對內(nèi)參基因引列，分別為 18S 為 180bp，，ACT 為 224bp，TuB 為 190 bp 的目的片段 (圖 3.2)，目的條后續(xù)試驗。測序結(jié)果經(jīng) Blast 序列比對分析源性為 99%。
【學位授予單位】：中國計量大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S435.711

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本文編號：2622801