【摘要】：歐李是我國(guó)特有的灌木果樹(shù),果實(shí)色澤鮮艷,風(fēng)味獨(dú)特,香氣濃郁,營(yíng)養(yǎng)豐富。研究其色澤與風(fēng)味的代謝具有重要意義。CCDs基因可以在類(lèi)胡蘿卜素的不同位點(diǎn)發(fā)生催化裂解,生成多種脫輔基類(lèi)胡蘿卜素,脫輔基類(lèi)胡蘿卜素具有多種生物學(xué)功能,如CCD1和CCD4主要調(diào)控植物果實(shí)的色澤和風(fēng)味,CCD7和CCD8參與了獨(dú)金角素的合成,NCED是脫落酸合成步驟中主要的限速酶。本研究以歐李品種'農(nóng)大4號(hào)'為材料,從中克隆到ChCCD1基因和ChCCD4基因,構(gòu)建了原核表達(dá)載體,導(dǎo)入合成類(lèi)胡蘿卜素的工程菌中,通過(guò)觀察菌液顏色的變化和GC-MS檢測(cè)裂解產(chǎn)物,分析了 ChCCDs基因功能。旨在為某些色澤與風(fēng)味相關(guān)基因的功能研究提供思路和方法,為歐李育種奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下(1)對(duì)歐李轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析,利用RT-PCR克隆方法獲得了歐李的兩個(gè)ChCCDs基因的CDS序列,分別為ChCCD1和ChCCD4。其中ChCCD1基因CDS序列長(zhǎng)度為1644bp,編碼547個(gè)氨基酸;ChCCD4基因CDS長(zhǎng)度為1794bp,編碼597個(gè)氨基酸,生物信息分析發(fā)現(xiàn)兩個(gè)ChCCDs基因都屬于CCDs基因家族,ChCCD1和ChCCD4基因編碼的蛋白都含有RPE65保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn),歐李CCDs蛋白與梅,桃和梨等果樹(shù)的CCDs蛋白親緣關(guān)系較近。(2)以歐李品種'農(nóng)大4號(hào)','農(nóng)大5號(hào)','農(nóng)大6號(hào)'和'農(nóng)大7號(hào)'不同成熟期果實(shí)為實(shí)驗(yàn)材料,提取每個(gè)品種果實(shí)不同時(shí)期的總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,通過(guò)熒光定量PCR分析CCDs基因在四個(gè)歐李品種果實(shí)不同成熟其的表達(dá)量。結(jié)果表明:ChCCD1在四個(gè)品種中總體表達(dá)量在幼果期較高,成熟期較低;ChCCD4在'農(nóng)大4號(hào)'幼果期表達(dá)量較高,成熟期較低,在其他三個(gè)品種中,幼果期表達(dá)量相對(duì)較低,成熟期相對(duì)較高(3)將ChCCDs基因連接到原核表達(dá)載pet-28a上,構(gòu)建原核表達(dá)載體pet-ChCCD1和pet-ChCCD4。將兩個(gè)原核表達(dá)載體分別導(dǎo)入能夠合成類(lèi)胡蘿卜素的工程菌中,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ChCCD1能夠降解番茄紅素β-胡蘿卜素和玉米黃素,ChCCD4也能降解番茄紅素和β-胡蘿卜素,但沒(méi)有ChCCD1顯著,ChCCD4幾乎不降解玉米黃素。GC-MS分析ChCCDs基因的裂解產(chǎn)物,發(fā)現(xiàn)ChCCD1裂解番茄紅素生成了 6-甲基-5庚烯-2酮,裂解β-胡蘿卜素生成了 β-紫羅蘭酮。
【圖文】：

Ｆｉｇ邋１－２邋ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋ｆｏｒ邋ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ逡逑歐文氏闡的１ｌ個(gè)合成＋邋１４類(lèi)胡蘿卜者的堪因質(zhì)粒載體，分別足ｐＡＣＣＲＴ－Ｅ．，邋ｐＡＣＣＲＴ－ＥＢ，逡逑ｐＡＣＣＲＴ－ＥＢｌ，邋ｐＡＣＣＡＲ１６ＡｃｒｔＸ邋和邋ｐＡＣＣＡＲ２５ＡｃｒｔＸ邋（闖邋１－２，圖片摘自文獻(xiàn)州）這／ｌ逡逑個(gè)質(zhì)粒載體分別能合成櫳卞兒基垅１邋？？?jī)夯沽姿�，八氫番茄紅素，番茄紅素，Ｐ－胡蘿卜逡逑＊

以歐李果實(shí)ＲＮＡ反轉(zhuǎn)錄合成的ｃＤＮＡ為模板，根據(jù)歐李轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)找到的逡逑基因的ＣＤＳ序列設(shè)計(jì)引物，ＰＣＲ擴(kuò)增得到了邋ＣＣＤ／和ＣＣＺＷ基因，命名為ＣＴｚＣＣＤ／和逡逑０＾０）４。與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的基因序列大小相同，，分別１６４物？和１７９樸？，如圖２－２，左逡逑圖為Ｃ７ＣＣＤ／右圖為0７ＣＯ＾。將ＣＣＤｓ基因連接到克隆載體，導(dǎo)入大腸桿菌ＤＨ５ｃｔ，逡逑ＰＣＲ擴(kuò)增的目的列測(cè)序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序一致。逡逑Ｍ邋１邐２邐１邐２邋Ｍ逡逑＾邐購(gòu)逡逑ｉ５00ｂｐ邐１000詠逡逑７５０ｂｐ邐７Ｓ0ｂｐ逡逑５００ｂｐ邐５００邋ｂｐ逡逑ｘｏｏｂｐ邐ＢＢＨＢａ邋２５0ｂｐ逡逑ｉ00ｂｐ逡逑圖２－２邋Ｃ／？ＣＣＤｓ基因ＰＣＲ凝膠電泳圖逡逑Ｆｉｇ．２－２邋Ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ＣｈＣＣＤｓ逡逑２０逡逑
【學(xué)位授予單位】：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S662.5

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本文編號(hào)：2610818