【摘要】：蛋白酶抑制劑是一類能抑制蛋白酶的水解活性的多肽或蛋白,廣泛存在于生物體內(nèi),在許多生命活動過程中都發(fā)揮著必不可少的作用。Serpin是絲氨酸蛋白酶抑制劑中數(shù)量最多、分布最廣的一個超家族,它主要通過調(diào)控絲氨酸蛋白酶(serine proteases,SPs)和半胱氨酸蛋白酶(cysteine proteases,CPs)的活性來發(fā)揮作用。昆蟲serpin可以通過抑制絲氨酸蛋白酶的活性調(diào)控機體的免疫防御反應。為了闡明serpin在柞蠶(Antheraea pernyi)免疫防御系統(tǒng)中的作用,從serpin基因的克隆入手,研究了serpin基因的結(jié)構(gòu)、進化以及表達特征等信息,為進一步研究柞蠶對病原微生物的免疫防御反應奠定基礎,結(jié)果如下:1.柞蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑6基因(Apserpin-6)的克隆依據(jù)柞蠶中腸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中一段編碼serpin的CDS序列設計PCR引物,以柞蠶幼蟲總cDNA為模板克隆得到一段全長1 239 bp的序列,經(jīng)序列分析后命名為柞蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑6基因(Apserpin-6)(GenBank登錄號:MF944108)。該基因編碼412個氨基酸殘基,其中N端第1~17位氨基酸為信號肽序列,在C端第357~391位氨基酸之間有一個反應中心環(huán)(RCL),第374位絲氨酸(Serine)和第375位絲氨酸之間是預測的蛋白質(zhì)裂解位點,證明其屬于serpin超家族,是典型的抑制型serpin。預測的Apserpin-6蛋白的分子質(zhì)量(Mw)為46.49 kDa,等電點(pI)為7.15,含有6個磷酸化位點。2.柞蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑6基因(Apserpin-6)系統(tǒng)進化分析序列同源性分析表明,Apserpin-6與其他昆蟲serpin-6序列之間具有高度的相似性,系統(tǒng)進化分析表明Apserpin-6與煙草天蛾(Manduca sexta)Msserpin-6、家蠶(Bombyx mori)Bmserpin-6及野桑蠶(Bombyx mandarina)Bmdserpin-6之間的親緣關系較近,且與Bmserpin-6、Bmdserpin-6聚在一個分支上。3.柞蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑6基因(Apserpin-6)的表達譜分析半定量RT-PCR結(jié)果顯示Apserpin-6在柞蠶5齡幼蟲的脂肪體中表達水平最高,血淋巴和頭部組織次之,在中腸、馬氏管和絲腺中的表達水平較低;熒光定量RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)受到柞蠶腸球菌(Enterococcus pernyi)、白僵菌(Beauveria bassiana)以及柞蠶核型多角體病毒(Antherea pernyi nucleopolyhedrovirus)侵染后柞蠶幼蟲的血淋巴中Apserpin-6表達量均顯著上調(diào)。4.柞蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑6基因(Apserpin-6)的原核表達及功能分析利用原核表達系統(tǒng)pEASY~?-Blunt E1-Apserpin-6/BL21(DE3)表達重組Apserpin-6蛋白,重組蛋白經(jīng)鎳離子鰲合親和層析分離純化后用于體外試驗,檢測其對柞蠶幼蟲血淋巴中的酚氧化酶前體(prophenoloxidase,proPO)活化及酚氧化酶(phenoloxidase,PO)酶活的抑制作用,試驗結(jié)果顯示該重組蛋白能夠抑制proPO的活性,但對PO活性沒有影響。綜上,本研究克隆得到了柞蠶一個抑制型serpin的基因——Apserpin-6,該基因在血淋巴中表達水平受病原菌誘導后明顯上調(diào);原核表達的重組Apserpin-6蛋白體外活性試驗提示Apserpin-6可能作為一種負調(diào)控因子參與proPO的活化進程,從而調(diào)控柞蠶血淋巴中PO參與的抗病原菌免疫防御反應。
【圖文】：

nevadensisZootermopsis nevadensis2.4 結(jié)果與分析2.4.1 柞蠶總 RNA 的檢測提取的柞蠶總 RNA 樣品 1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示無基因組 DNA 污染（圖2-1），，并且分光光度法檢測其 OD260/OD280 值為 1.96，RNA 樣品濃度為 676.23 μg mL-1（表 2-5），表明提取的柞蠶 RNA 純度較好，可用于下一步試驗。表 2-5 分光光度計檢測柞蠶 RNA 樣品質(zhì)量Table 2-5 The quality of extracted A. pernyi RNA detected by spectrophotometer樣品 OD260/OD280 濃度（μg mL-1）柞蠶總 RNA 1.96 676.23

瓊脂糖凝膠電泳檢測柞蠶 RNAd A. pernyi total RNA detected b蠶總 RNA。Note: M represents 10 kb A 樣進行反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA后照膠，發(fā)現(xiàn)大小約 1.2 k序列大小相符，初步判斷擴
【學位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S885.1

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本文編號：2600540