【摘要】：植物基因工程研究中的一項(xiàng)重要且前沿的課題是基因的表達(dá)和調(diào)控,而啟動(dòng)子及其順式作用元件在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控起重要作用,已經(jīng)成為分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子能在受到脅迫時(shí)誘導(dǎo)啟動(dòng)基因的表達(dá),降低自身的傷害,避免能量浪費(fèi)。百合具有食用、藥用和觀賞價(jià)值,但百合易受病害、不良環(huán)境影響,而利用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)和功能特性可以提高百合等植物抗逆性。本研究基于課題組成果積累,選取岷江百合和毛百合作為試驗(yàn)材料,利用生物信息學(xué)分析對(duì)兩種百合GPAT基因進(jìn)行序列分析,利用熒光定量PCR技術(shù)分析基因表達(dá)量,利用基因克隆技術(shù),克隆兩種百合GPAT基因啟動(dòng)子的缺失片段并進(jìn)行煙草轉(zhuǎn)化,主要結(jié)果如下:1.將毛百合LpGPAT和岷江百合LrGPAT進(jìn)行同源比對(duì),同源性為96.34%。通過(guò)對(duì)擬南芥ATS1蛋白、多種其它GPAT蛋白和兩種百合GPAT蛋白保守結(jié)構(gòu)域查找和比較發(fā)現(xiàn),兩種百合GPAT蛋白和其它植物GPAT蛋白同樣具有保守性強(qiáng)的�；D(zhuǎn)移酶活性結(jié)構(gòu)域:motifsI,II,III和IV,該結(jié)構(gòu)域在利用在線軟件SMART分析兩種百合GPAT的結(jié)構(gòu)域的范圍內(nèi),即毛百合和岷江百合GPAT氨基酸序列在176-322位和169-315位有一個(gè)PlsC酰基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域,說(shuō)明GPAT蛋白屬于�；D(zhuǎn)移酶家族成員,具有�；D(zhuǎn)移酶的活性。利用在線軟件TMHMM Server 2.0對(duì)兩種百合GPAT結(jié)構(gòu)域序列進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果表明兩種百合GPAT結(jié)構(gòu)域可能具有疏水性且不含跨膜區(qū)。利用在線軟件SignalIP 4.0對(duì)兩種百合GPAT結(jié)構(gòu)域序列的信號(hào)肽區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果表明兩種百合的GPAT結(jié)構(gòu)域序列可能都沒(méi)有信號(hào)肽。對(duì)兩種百合GPAT基因啟動(dòng)子序列利用NewPLACE、PlantCARE等分析預(yù)測(cè)網(wǎng)站分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在序列中包含許多的TATA-box、CAAT-box等核心順式元件,另外還有許多與逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件:MYC、TC-rich repeats、MYB、ABRE、MBS和DRE等。2.利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究?jī)煞N百合GPAT基因表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)通過(guò)ABA誘導(dǎo)后,兩種百合GPAT基因表達(dá)量均呈升高趨勢(shì),其中岷江百合表達(dá)量升高更加明顯。3.根據(jù)序列分析結(jié)果,將LpGPAT全長(zhǎng)啟動(dòng)子序列從5’端截短成1466 bp、884 bp、566bp、412bp的不同長(zhǎng)度序列,分別命名為GPAT F1、GPAT F2、GPAT F3、GPAT F4,用以替換植物表達(dá)載體PCAMBIA1303上的35S啟動(dòng)子。4.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉片注射法進(jìn)行煙草轉(zhuǎn)化,通過(guò)缺失分析結(jié)合GUS組織化學(xué)染色揭示了LpGPAT啟動(dòng)子844 bp和LrGPAT啟動(dòng)子384 bp的片段可以驅(qū)動(dòng)GUS在煙草中的誘導(dǎo)性表達(dá)。因此,猜測(cè)384 bp的片段是最小的具有活性的GPAT基因啟動(dòng)子。
【圖文】：

圖 2-2 SMART 預(yù)測(cè) GPAT 結(jié)構(gòu)域序列比對(duì)Fig. 2-2 SMART predicted GPAT Domain Sequence Alignment2.2.2 兩種百合 GPAT 蛋白的疏水性和跨膜分析圖 2-3 中縱軸表示親水指數(shù)，橫軸表示氨基酸位置，指數(shù)為正表示疏水，指數(shù)為負(fù)表示親水，正數(shù)越大表示越疏水。兩種百合 GPAT 結(jié)構(gòu)域（A 為毛百合 LpGPAT，，B為岷江百合 LrGPAT）的疏水性分析結(jié)果顯示：最大的疏水峰值分別為岷江百合-2.744、毛百合-2.744 最大的親水峰值分別為岷江百合 2.289、毛百合 2.189。疏水氨基酸殘基79 個(gè)明顯多于 67 個(gè)親水氨基酸，符合結(jié)構(gòu)域親疏水性特征，兩種百合 GPAT 結(jié)構(gòu)域的疏水性分析中只有其中 140 位置出現(xiàn)親水性數(shù)值大小差異，但是不存在親疏水性差異，推測(cè)結(jié)構(gòu)域功能相差不大。A B

圖 2-4 Tmpred 預(yù)測(cè)兩種百合 GPAT 跨膜區(qū)Fig.2-4 Prediction of transmembrane helices in 2 kinds of Liliums GPAT2.2.3 兩種百合 GPAT 蛋白的信號(hào)肽分析預(yù)測(cè)信號(hào)肽的基本組成是一般由 5 個(gè)帶正電的氨基酸組成的 N 端、一個(gè)由疏水氨基酸組成的疏水 H 區(qū)和有更多極性氨基酸分布的更強(qiáng)極性的 C 區(qū)，如下圖所示：根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果分析這兩個(gè)蛋白可能沒(méi)有信號(hào)肽（A 為 LpGPAT，B 為 LrGPAT），但目前的研究顯示對(duì)抗寒起作用的 GPAT 定位于葉綠體，而我們對(duì)這兩種百合 GPAT的定位預(yù)測(cè)也是在葉綠體上，猜測(cè)其在葉綠體外膜上起作用。A B
【學(xué)位授予單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q943.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2599633