【摘要】：【目的】克隆蘋果細(xì)胞分裂素響應(yīng)因子基因Md CRF6(cytokinin response factor 6),鑒定其在調(diào)節(jié)花青苷積累和鹽脅迫抗性中的作用,揭示Md CRF6的功能,為研究細(xì)胞分裂素信號(hào)途徑和果樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控提供理論依據(jù)�！痉椒ā恳浴吕病O果(Malus domestica‘Gala’)為研究材料,利用同源序列比對(duì)和PCR技術(shù),分離細(xì)胞分裂素響應(yīng)基因Md CRF6。使用MEGA 5.0軟件構(gòu)建蘋果Md CRF6與擬南芥CRFs間系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù);通過(guò)SMART軟件和DNAMAN軟件分析Md CRF6蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)該基因?qū)?xì)胞分裂素和鹽脅迫的響應(yīng)。通過(guò)電泳遷移率試驗(yàn)(EMSA),驗(yàn)證Md CRF6原核表達(dá)蛋白對(duì)DRE作用元件的綁定。構(gòu)建Md CRF6植物超表達(dá)載體,并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)Md CRF6蘋果愈傷組織。比較野生型和轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織在花青苷積累和鹽抗性方面的差異,結(jié)合基因表達(dá)分析,初步鑒定Md CRF6在調(diào)節(jié)花青苷積累和鹽脅迫方面的生物學(xué)功能�！窘Y(jié)果】分離得到了蘋果細(xì)胞分裂素響應(yīng)因子基因Md CRF6(基因序列號(hào):MDP0000783818),該基因開(kāi)放閱讀框(ORF)為1 047 bp,編碼含有348個(gè)氨基酸的蛋白。進(jìn)化樹(shù)分析和氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明,蘋果Md CRF6蛋白在N端包含保守的CRF結(jié)構(gòu)域,在C端包含保守的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域,并且與擬南芥At CRF6同源性最高�；虮磉_(dá)分析顯示該基因具有細(xì)胞分裂素和鹽脅迫響應(yīng),分別在10μmol·L-1 BA和100 mmol·L-1 Na Cl處理3 h和6 h時(shí)表達(dá)量最高。EMSA試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證Md CRF6原核表達(dá)蛋白能夠綁定DRE序列。在蘋果愈傷組織中超表達(dá)Md CRF6,發(fā)現(xiàn)Md CRF6轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織花青苷積累受到抑制,同時(shí)蘋果愈傷組織的抗鹽性降低�；虮磉_(dá)分析顯示,Md CRF6顯著抑制花青苷合成基因和鹽響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)�！窘Y(jié)論】蘋果Md CRF6與擬南芥At CRF6具有高度的同源性,其參與植物對(duì)細(xì)胞分裂素和鹽脅迫的響應(yīng)。在蘋果愈傷組織中超量表達(dá)Md CRF6抑制其花青苷積累,降低植物抗鹽性。推測(cè)蘋果Md CRF6可能通過(guò)結(jié)合花青苷合成基因以及抗鹽相關(guān)基因的啟動(dòng)子,抑制基因的表達(dá),從而負(fù)調(diào)節(jié)花青苷積累和抗鹽性。
【圖文】：

苷含量。計(jì)算公式：OD=（A530-A620）-0.1×(A650-A620)。1.7蘋果愈傷組織鹽脅迫試驗(yàn)選擇生長(zhǎng)狀態(tài)一致的野生型（WT）和轉(zhuǎn)基因（MdCRF6-L1和MdCRF6-L2）蘋果愈傷組織進(jìn)行鹽脅迫試驗(yàn)。將大小一致的愈傷放置到含有不同NaCl濃度的繼代培養(yǎng)基上。常溫、暗處培養(yǎng)15d，觀察并稱量愈傷組織的質(zhì)量。1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用R（3.0.2）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有結(jié)果都是基于3個(gè)平行試驗(yàn)的平均值。2結(jié)果2.1蘋果MdCRF6的克隆及同源性分析以‘嘎啦’幼苗的cDNA為模板，MdCRF6-F/R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得一條大約1000bp的條帶（圖1）。對(duì)克隆得到的片段測(cè)序分析，結(jié)果表明，，該基因片段的開(kāi)放閱讀框（ORF）長(zhǎng)度為1047bp，編碼含有348個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，命名為MdCRF6（MDP0000783818）。圖1蘋果MdCRF6的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳Fig.1ElectrophoresisofRT-PCRproductsforMdCRF6cloning將蘋果MdCRF6氨基酸序列與擬南芥中12個(gè)細(xì)胞分裂素響應(yīng)因子基因（AtCRF1—AtARF12）的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)（圖2）。進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明，蘋果MdCRF6與擬南芥AtCRF6親緣關(guān)系最近，同源性最高。AtCRF6AT3G61630.1MdCRF6MDP0000783818AtCRF11AT3G25890.1AtCRF3AT5G53290.1AtCRF10AT1G68550.1AtCRF3AT4G23750.1AtCRF4AT4G27950.1AtCRF1AT4G11140.1AtCRF9AT1G49120.1AtCRF5AT2G46310.1AtCRF12AT1G25470.1AtCRF1AT1G22985.10.05AtCRF1AT1G71130.1At：擬南芥Arabidopsisthaliana；Md：蘋果Malusdomestica圖2蘋果MdCRF6與擬南芥CRFs的進(jìn)化樹(shù)分析Fig.2PhylogenetictreeanalysisofMdCRF6withCRFsfromArabidopsis對(duì)蘋果MdCRF6的氨基酸序列進(jìn)行分析（圖3）。結(jié)果顯示，MdCRF6僅包含一個(gè)外顯子，無(wú)內(nèi)含子。MdCRF6蛋白在N端包含一個(gè)保守的CRF結(jié)

薈CGAC）序列突變?yōu)?CCGGAG-，結(jié)合條帶消失（圖5）。2.4載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷組織鑒定構(gòu)建MdCRF6超表達(dá)載體MdCRF6-pCAMBIA1300（圖6），轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化侵染蘋果愈傷組織。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因株系MdCRF6表達(dá)量（圖7）。獲得L1和L2兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系。ARR6啟動(dòng)子序列pARR6:-GCAAGATTTAACCGACCCAAACCGAT-ARR6啟動(dòng)子突變序列pARR6(Mut):-GCAAGATTTACCGGAGCCAAACCGAT-5×10×Mut自由探針Free-Probe結(jié)合探針Bound-ProbeCompetitorBiotin-ProbeGST-MdCRF6GST圖5MdCRF6綁定DRE序列Fig.5MdCRF6bindstoDREmotif

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