【摘要】：磷在植物生長發(fā)育中起著關鍵的作用,大量營養(yǎng)元素中磷的缺少會影響到植物生長的各個環(huán)節(jié)。磷素在土壤中的含量很多但是可利用的卻很少,為了應對這些環(huán)境條件的制約,植物進化出了自己的磷素利用系統(tǒng)。磷轉運蛋白PHT1家族對磷的吸收和利用起到了關鍵作用,在磷脅迫的條件下,大多數(shù)的磷轉運蛋白基因都進行了大量表達來提高細胞體內(nèi)的磷素含量。番茄(Solanum lycopersicum)是主要蔬菜栽培作物,缺磷可引起番茄的產(chǎn)量和品質下降,研究番茄高親和磷轉運蛋白SlPT1基因的功能可以幫助解決番茄對磷素的利用。本課題構建了SlPT1基因的過表達載體對擬南芥突變體進行遺傳轉化,驗證其在擬南芥突變體中的功能。對SlPT1基因啟動子進行了克隆,并對其特性進行初步研究。具體實驗結果如下:1.通過NCBI在線查找番茄基因數(shù)據(jù)庫,獲得了番茄SlPT1基因的序列,分析定位開放閱讀框并進行設計引物,PCR擴增獲得了一條長為1654bp的片段序列。通過Blast基因序列比對與氨基酸序列比對進行分析,番茄磷轉運蛋白基因SlPT1的全長為2002bp(GenBank ACCESSION NM_001247432),開放閱讀框為1617bp,編碼一個538個氨基酸的蛋白質。番茄SlPT1基因編碼的磷轉運蛋白的分子式為:C_(2716)H_(4137)N_(673)O_(722)S_(29)。氨基酸的組成成分表2.6,分子量:58699.54D,等電點為8.51,平均親水系數(shù)0.401,不穩(wěn)定系數(shù)29.20。番茄SlPT1與擬南芥AtPT4有高同源性。2.將擴增克隆得到的SlPT1基因連接到T-Vector pMD 19載體上并轉化大腸桿菌,然后進行測序。將測序正確的提取質粒,SlPT1-T質粒和pCAMBIA3301/Luc載體質粒用分別用XbaⅠ和XmaⅠ限制性內(nèi)切酶進行處理,然后進行連接轉化,將構建的表達載體命名為SlPT1-pCAMBIA3301/Luc。3.用農(nóng)桿菌介導的蘸花法進行遺傳轉化擬南芥突變體,篩選并獲得了轉基因植株,進而獲得T1代種子。進而對T1代植株進行表型觀察,相比于對照植株,轉基因植株在正常培養(yǎng)條件下未出現(xiàn)缺磷癥狀差異不明顯,但是根部形態(tài)變化明顯。轉基因植株提高了磷的吸收,在正常培養(yǎng)條件下高于對照,缺磷情況下和對照相比不明顯。4.擴增獲得了一條903bp大小的啟動子序列,在線進行序列分析和順式作用元件預測。將克隆得到的片段連接T-Vector pMD 19載體測序,將SlPT1-Pro-T質粒和pBI121載體質粒用酶切位點HindⅢ到XmaⅠ進行雙酶切,連接轉化并驗證,構建完成替換CaMV35S啟動子的表達載體。通過對擬南芥的瞬時表達,根據(jù)對照比較及其染色效果分析,SlPT1基因啟動子在根部活性明顯。綜上所述:構建完成了表達載體SlPT1-pCAMBIA3301/Luc。對轉基因植株處理,進行表型觀察,相比于對照植株轉基因植株在正常培養(yǎng)條件下未出現(xiàn)缺磷癥狀差異不明顯但是根部形態(tài)變化明顯。轉基因植株提高了磷的吸收,在正常培養(yǎng)條件下高于對照,缺磷情況下和對照相比不明顯。SlPT1基因啟動子對擬南芥的轉化,進行了初步研究,SlPT1基因啟動子在根部活性明顯。
【圖文】：

驟：5℃2 min4℃30 s60℃30 s 共 30 個循環(huán)72℃2 min72℃5 min 4℃+∞泳檢測確認。將條帶正確的菌液，，吸取 3余菌液加無菌的甘油放入-80℃保存。 為模板，利用特異性引物擴增 SlPT1 基，與預期片段大小相符（圖 2.1）。

圖 2.2 T- Vector pMD 19 質粒圖譜Fig. 2.2 T- Vector pMD 19 plasmid map圖 2.3 轉化大腸桿菌藍白斑篩選Fig. 2.3 Transform E. coli blue and white spot screening
【學位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S641.2

【參考文獻】

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本文編號：2589759