【摘要】：棉花是我國的重要經(jīng)濟作物,在國民經(jīng)濟中具有重要作用。棉花纖維是重要的天然纖維來源。棉纖維細胞是由胚珠外珠被表皮細胞經(jīng)快速突起和急速伸長而形成的單細胞,具有極度伸長的細胞形態(tài)。其生長發(fā)育經(jīng)歷了起始期、快速伸長期、成熟期和脫水期,是研究植物細胞發(fā)育的理想材料。同時,纖維細胞的發(fā)育過程也是棉花纖維產(chǎn)量和品質的形成過程,研究纖維細胞的發(fā)育及其調控機理是解析棉花纖維產(chǎn)量和品質(長度和細度等)形成機理的重要環(huán)節(jié),將為進一步培育高產(chǎn)優(yōu)質棉花提供理論基礎。近年來對棉花纖維發(fā)育的研究取得了一定進展,但目前調控棉纖維發(fā)育的分子機制仍不清楚。鞘脂(sphingolipids)是含有長鏈鞘樣堿基骨架的一類結構復雜的脂類分子,種類繁多,廣泛存在于生物膜結構中。鞘脂及其衍生物是許多細胞活動進程中重要的動力調節(jié)器,參與了許多重要的信號轉導過程,不同種類的鞘脂存在于不同組織中,甚至是不同組織的不同細胞類型中,目前對植物中鞘脂的研究甚少。在棉纖維細胞極性伸長過程中,生物膜系統(tǒng)的面積極度擴張,務必需要不同鞘脂分子的相應增加,以滿足各種生理生化活動所需,從而協(xié)調完成伸長過程。因此鞘脂的正常合成在纖維細胞生長發(fā)育中可能發(fā)揮了重要作用。為了研究鞘脂在棉花纖維細胞生長發(fā)育中的作用,首先克隆了棉花中3-酮基二氫鞘氨醇還原酶基因的同源基因Gh KDSR2s,然后構建反義表達載體并進行棉花的遺傳轉化,探索了下調Gh KDSR2-1對棉花植株和纖維生長發(fā)育的影響,主要結果如下:1.Gh KDSR2s基因的克隆和序列分析以陸地棉徐州142野生型10dpa的纖維c DNA為模板,擴增得到2個同源的Gh KDSR2基因。其中克隆到的Gh KDSR2-1的c DNA序列包含一個996bp的ORF,推導的ORF編碼331個氨基酸殘基,分子量36.0k D,IP=8.065�？寺〉降腉h KDSR2-2的c DNA序列包含一個999bp的ORF,推導的ORF編碼332個氨基酸殘基,分子量36.2k D,IP=7.436。Gh KDSR2與擬南芥、可可、蓖麻等物種的3-酮基二氫鞘氨醇還原酶基因具有較高的同源性。這些分析結果說明我們克隆得到的序列是棉花3-酮基二氫鞘氨醇還原酶基因的同源基因。2.Gh KDSR2-1基因的表達特性為了明確克隆得到的兩個Gh KDSR2基因表達特性,利用實時定量RT-PCR分別檢測了其在野生型棉花的不同組織器官、纖維和胚珠不同發(fā)育時期,以及纖維突變體的幾個重要時期的表達水平。結果表明,Gh KDSR2在檢測樣品中均有表達,但其表達水平存在明顯差異。在纖維發(fā)育過程中其表達峰值出現(xiàn)在快速伸長期,說明Gh KDSR2基因與纖維細胞伸長有一定關系;進一步檢測了該基因在纖維發(fā)育突變體中的表達差異,結果表明在徐州142無絨無絮突變體的纖維起始期和超短纖維突變體的纖維快速伸長期,Gh KDSR2的表達相較于野生型都有明顯下降,說明Gh KDSR2在纖維的起始和伸長階段可能發(fā)揮了重要作用。3.反義抑制Gh KDSR2-1對棉花植株生長發(fā)育的影響利用Gh KDSR2序列構建反義抑制植物表達載體,并進行棉花的遺傳轉化。通過GUS組織化學染色和PCR擴增鑒定獲得7個陽性轉化子。對轉基因棉花的性狀變異進行觀測和統(tǒng)計,結果顯示下調Gh KDSR2導致了植株矮小纖細,生長緩慢,難以成活;花小,花粉少且嚴重敗育,因此難以穩(wěn)果;棉桃變小,發(fā)育緩慢,且每個棉桃中僅有1-2粒種子發(fā)育成熟;葉片變小、顏色變深且表面粗糙。隨后進一步對葉片中葉綠素和木質素含量進行檢測,發(fā)現(xiàn)其葉綠素和木質素含量升高,木質素分布區(qū)域增多。結果表明,抑制Gh KDSR2-1表達,棉花植株生長發(fā)育受到嚴重干擾。4.反義抑制Gh KDSR2-1對棉花纖維細胞生長發(fā)育的影響為了明確Gh KDSR2-1對棉花纖維細胞生長發(fā)育的影響,首先采用棉花胚珠離體培養(yǎng)方法,檢測了轉基因纖維細胞的生長發(fā)育變化,結果發(fā)現(xiàn)抑制Gh KDSR2-1的表達明顯抑制纖維細胞的伸長,此結果與FB2(鞘脂合成抑制劑)處理野生型纖維的結果一致,說明植物鞘脂的正常合成在纖維細胞伸長中具有重要作用。轉基因成熟纖維的測量結果表明,抑制Gh KDSR2-1的轉基因纖維長度明顯降低,與對照相比,轉基因纖維長度降低了18.4%。該結果進一步說明Gh KDSR2基因在纖維伸長中有著重要作用。掃描電鏡觀察的結果表明,轉基因纖維細胞的起始受到抑制,起始數(shù)量明顯減少。這些結果證明下調Gh KDSR2-1抑制了纖維了起始和伸長,說明Gh KDSR2在纖維起始和伸長過程中發(fā)揮了重要作用。5.下調Gh KDSR2-1抑制棉花種子中脂類合成,提高蛋白質含量反義抑制Gh KDSR2-1棉花種子中脂類含量較野生型降低了2.6%左右,其中C18-0變化最為明顯,下降了約9.2%,而其蛋白含量較野生型升高了13.7%左右,說明下調Gh KDSR2-1抑制棉花種子中脂類合成,提高蛋白質含量。
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S562

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1 唐英才;下調棉花3-酮基二氫鞘氨醇還原酶基因（GhKDSR2-1）的表達對棉纖維發(fā)育的影響[D];西南大學;2016年

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本文編號：2586620