【摘要】：煙草是重要的模式植物和經(jīng)濟(jì)作物,鹽害和干旱兩種環(huán)境因子對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)都危害很大。為了提高煙草的耐鹽抗旱性,本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法在煙草中過(guò)量表達(dá)了堿蓬液泡膜Na~+/H~+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)基因SsNHX1,對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽及抗旱性進(jìn)行表型鑒定和各項(xiàng)生化指標(biāo)的檢測(cè),以期得到耐鹽抗旱表性良好的SsNHX1轉(zhuǎn)基因煙草。表型分析發(fā)現(xiàn),SsNHX1基因過(guò)表達(dá)株系L1和L5的抗鹽能力比野生型顯著提高,表現(xiàn)為鹽脅迫條件下仍能保持旺盛的生長(zhǎng)且根系的伸長(zhǎng)未受抑制。SsNHX1過(guò)表達(dá)株系在葉片和根系中積累了更多的Na~+和K~+,同時(shí)Na~+含量增長(zhǎng)速率較快,而K~+含量降低速率較緩,并可維持較高的葉片相對(duì)含水量和葉綠素含量,及較低的丙二醛含量和相對(duì)電導(dǎo)率。干旱脅迫發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)株系受干旱脅迫程度更小,并在復(fù)水后迅速恢復(fù)正常生長(zhǎng)。同時(shí),過(guò)表達(dá)株系的丙二醛含量和相對(duì)電導(dǎo)率顯著低于野生型,且維持了較高的葉片相對(duì)含水量及葉綠素含量。這些結(jié)果說(shuō)明SsNHX1基因在煙草中過(guò)量表達(dá)后,降低了鹽脅迫和干旱脅迫對(duì)煙草根系及細(xì)胞膜的損傷,并通過(guò)調(diào)節(jié)離子含量、降低細(xì)胞的滲透勢(shì),維持了葉片較高的相對(duì)含水量和葉綠素含量,最終提高了煙草的抗鹽和抗旱性。
【圖文】：

1520中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)2017第25卷http://www.ecoagri.ac.cn的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液處理24h,提取葉片DNA以及Trizol法提取葉片RNA。SsNHX1基因通過(guò)XbaI和SmaI酶切位點(diǎn)連接在植物表達(dá)載體pCPB(改自pCambia3300)的35S啟動(dòng)子之后(圖1a),用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物中的SsNHX1片段的引物是tSsNHX1-F(5-AGGGAGCAAAGACAAGAG-3)和tSsNHX1-R(5-TCTTCTATCTGAGCGGAATT-3)。并使用引物qSsNHX1-F(5-GTCATTTGGTGGGCTGGTCTC-3)和qSsNHX1-R(5-TGAAAAGGACAACGGTTATGGTG-3)進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),篩選出SsNHX1基因高表達(dá)株系。1.3鹽脅迫下SsNHX1轉(zhuǎn)基因煙草耐鹽性分析將溶液培養(yǎng)的SsNHX1轉(zhuǎn)基因株系L1和L5及野生型煙草幼苗,用0g·L1、2.5g·L1、5g·L1、7.5g·L1NaCl進(jìn)行處理,每個(gè)株系3株煙草,每個(gè)鹽濃度處理重復(fù)3次,處理7d,每2d更換一次營(yíng)養(yǎng)液。處理結(jié)束取樣,用根系掃描儀掃描根系,觀察煙草幼苗的生長(zhǎng)狀況并測(cè)量根系的長(zhǎng)度;隨后用火焰分光光度計(jì)分別測(cè)定野生型和轉(zhuǎn)基因煙草株系的根系和葉片中Na+和K+離子含量。1.4干旱脅迫下SsNHX1轉(zhuǎn)基因煙草耐旱性分析土壤培養(yǎng)的SsNHX1轉(zhuǎn)基因株系L1和L5及野生型幼苗長(zhǎng)至9~10葉期,每個(gè)株系3株煙草,每個(gè)處理天數(shù)重復(fù)3次,進(jìn)行斷水12d干旱處理后再?gòu)?fù)水3d,從每株葉片中間部分取樣,觀測(cè)其在斷水0d、3d、6d、9d、12d及復(fù)水1d、3d的生長(zhǎng)情況。1.5鹽脅迫和干旱脅迫下SsNHX1轉(zhuǎn)基因煙草生理生化指標(biāo)測(cè)定分別將鹽脅迫和干旱脅迫處理后的野生型和SsNHX1轉(zhuǎn)基因株系L1和L5煙草進(jìn)行生理生化指標(biāo)的鑒定,包括:相對(duì)含水量(relativewatercontent,RWC)[21]、葉綠素含量[22]、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量[23]、相對(duì)電導(dǎo)率[24]。所得數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件分析,并用MicrosoftExcel軟件作圖。2結(jié)果與分析2.

第10期陳鑫等:轉(zhuǎn)堿蓬SsNHX1基因煙草的耐鹽抗旱性研究1521http://www.ecoagri.ac.cn的根長(zhǎng)進(jìn)行了研究。在無(wú)鹽脅迫下,兩者總根長(zhǎng)無(wú)顯著性差異,但在鹽脅迫下,轉(zhuǎn)基因煙草L1和L5與野生型的總根長(zhǎng)差異顯著(圖2b)。且隨著鹽處理濃度的升高,野生型的總根長(zhǎng)明顯變短,而轉(zhuǎn)基因株系L1和L5的總根長(zhǎng)降低幅度較小,如在7.5g·L1NaCl濃度處理下轉(zhuǎn)基因株系L1和L5根長(zhǎng)分別是野生型煙草的2.64和2.72倍,差異顯著。說(shuō)明鹽脅迫雖然都抑制著煙草根系的生長(zhǎng),但轉(zhuǎn)基因株系受到的抑制作用相對(duì)較輕,基本不影響其根系的生長(zhǎng)發(fā)育。圖2鹽脅迫處理后SsNHX1轉(zhuǎn)基因煙草和野生型的表型(a)及根長(zhǎng)(b)Fig.2Phenotype(a)androotlength(b)ofSsNHX1-transgenictobaccoplantsandwidetypeplantsaftersaltstresstreatmenta:幼苗在0g·L1、0.25g·L1、0.50g·L1和0.75g·L1的NaCl梯度濃度霍格蘭溶液中培養(yǎng),直到三葉期;b:經(jīng)過(guò)NaCl濃度梯度處理后的根長(zhǎng)。WT為野生型煙草;L1和L5為SsNHX1煙草轉(zhuǎn)基因株系;*表示差異顯著,誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)方差。a:seedlingswerehydratedwithHoaglandnutrientsolutionwithanincreasedNaClgradientof0g·L1,2.5g·L1,5g·L1and7.5g·L1(w/v)untilthethree-leafstage;b:rootlengthafterimmersionin0g·L1,2.5g·L1,5g·L1,and7.5g·L1NaCl.WTiswildtypetobacco;L1andL5areSsNHX1transgenictobaccolines.*indicatessignificantdifference.Valuesoferrorbararemeansstandarddeviation.2.3SsNHX1轉(zhuǎn)基因煙草在鹽脅迫條件下根系和葉片的Na+和K+含量植物體吸收過(guò)高的Na+,會(huì)導(dǎo)致植物體營(yíng)養(yǎng)離子的失衡,特別是K+的吸收抑制和流失。在鹽脅迫條件下液泡Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白則會(huì)將Na+

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