【摘要】：CYC基因編碼西柏三烯一醇合成酶,是煙草腺毛分泌物合成的關(guān)鍵基因。為明確CYC基因的表達(dá)規(guī)律,本文利用RT-PCR技術(shù),對(duì)煙草不同類型(達(dá)白1號(hào)、雪茄1號(hào)、Basma、K326)、不同烤煙品種(K326、中煙100、紅花大金元、翠碧1號(hào)、豫煙11號(hào))和煙草K326不同組織(根、莖、上部葉、中部葉、下部葉、腺毛、去腺毛葉片、花)中的CYC基因的表達(dá)進(jìn)行了系統(tǒng)分析。在此基礎(chǔ)上,克隆了CYC基因啟動(dòng)子序列,構(gòu)建了CYC-Pro-GUS infusion表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化煙草,通過對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色和GUS酶活檢測(cè),分析了CYC啟動(dòng)子的組織表達(dá)特性及其對(duì)溫度應(yīng)答反應(yīng)模式。另外,對(duì)CYC-RNAi轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了農(nóng)藝性狀和葉面化學(xué)成分分析,為該基因在煙草抗性及品質(zhì)改良中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下。1.利用RT-PCR技術(shù),分析了煙草不同類型、不同烤煙品種、不同組織器官中CYC基因的表達(dá)特性:在不同煙草類型中,香料煙Basma中CYC基因相對(duì)表達(dá)量最高,其次是烤煙K326,雪茄1號(hào)和達(dá)白1號(hào)中較低;在烤煙不同品種中,K326中CYC基因的相對(duì)表達(dá)量顯著最高,其次為“紅大”和“豫煙11號(hào)”,“翠碧1號(hào)”較低,“中煙100”最低;在煙草K326不同組織中,腺毛中CYC基因表達(dá)量顯著高于花、去腺毛葉片、上部葉、中部葉、下部葉、根和莖。說明煙草CYC基因的表達(dá)具有類型、品種及組織特異性。2.煙草CYC基因啟動(dòng)子活性分析:從煙草品種8306 DNA中分離出CYC基因啟動(dòng)子,并將啟動(dòng)子插入p C-NPT-GUS載體中,構(gòu)建了表達(dá)載體p C-CYC-Pro-GUS,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和葉盤法轉(zhuǎn)化煙草K326,在Kan濃度30mg/ml條件下篩選得到陽性植株,取轉(zhuǎn)基因煙草和對(duì)照K326的根、莖和葉片,分別進(jìn)行GUS染液染色,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的葉片和莖上的腺毛均染上藍(lán)色,而K326沒有。證明CYC基因啟動(dòng)子成功整合至煙草K326的基因組中,并使外源基因GUS在煙草腺毛中特異表達(dá),說明CYC基因啟動(dòng)子在腺毛中特異表達(dá)。進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)基因植株分別進(jìn)行4℃和42℃的溫度處理,對(duì)照為28℃條件下的轉(zhuǎn)基因植株,在1小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)時(shí)分別取樣,提取GUS酶蛋白,進(jìn)行GUS酶活檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),經(jīng)過4℃和42℃處理的轉(zhuǎn)基因煙草的GUS酶活性均小于28℃條件下的活性,表明煙草CYC基因啟動(dòng)子的表達(dá)受溫度調(diào)控。3.CYC基因抑制表達(dá)對(duì)煙草葉面化學(xué)的影響:將10個(gè)CYC-RNAi轉(zhuǎn)基因株系在可控條件下進(jìn)行田間試驗(yàn),按照優(yōu)質(zhì)煙草栽培技術(shù)規(guī)范進(jìn)行栽培管理。在煙葉成熟期時(shí)采用圓片法提取腺毛分泌物并進(jìn)行GC/MS檢測(cè)分析,結(jié)果顯示5個(gè)CYC-RNAi轉(zhuǎn)基因株系中,西柏三烯一醇、西柏三烯二醇含量低于對(duì)照,烷烴類化合物與糖酯類化合物含量與對(duì)照保持一致;而CYC-RNAi-19、CYC-RNAi-22含量比對(duì)照提升明顯,可能與插入位點(diǎn)特異有關(guān)。
【圖文】：

西柏三烯醇類合成途徑基因的調(diào)控下合成單萜化合物，在二萜合成相關(guān)基因的調(diào)控下合成二萜化合物，也能在一定

不同類型煙草 CYC 基因表達(dá)分析提取三種類型的煙草的 RNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，，結(jié)果如圖出，Basma 中 CYC 基因的相對(duì)表達(dá)量顯著最高， K326、達(dá)白 1 號(hào)和雪茄中的 C達(dá)量較低；CYC 基因在 K326 和林煙草中表達(dá)，在絨毛煙草中不表達(dá)，說明種植6 中能夠表達(dá)的 CYC 基因來源于母本林煙草。
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S572

【參考文獻(xiàn)】

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1 崔喜艷;陳眾峰;范貝;韓琳;劉曉慶;董雅致;張治安;;大豆rbcS基因啟動(dòng)子的克隆及在轉(zhuǎn)基因煙草中的功能缺失分析[J];西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2015年05期

2 杜皓;丁林云;何曼林;蔡彩平;郭旺珍;;受多逆境誘導(dǎo)表達(dá)的GhWRKY64基因啟動(dòng)子克隆與功能分析[J];作物學(xué)報(bào);2015年04期

3 王冬;張小全;彭玉富;張笛;李麗華;楊鐵釗;;晝夜溫差和光照強(qiáng)度對(duì)煙草西柏三烯二醇的合成及CYC-1、CYP71D16基因表達(dá)的影響[J];華北農(nóng)學(xué)報(bào);2014年05期

4 趙紅玉;徐磊;魏溪涓;鄧敏娟;王芳;易可可;;一個(gè)新水稻根尖特異表達(dá)啟動(dòng)子的分離與鑒定[J];中國(guó)水稻科學(xué);2014年04期

5 楊學(xué)文;任遠(yuǎn);田曾元;張生學(xué);劉允軍;王國(guó)英;;玉米莖特異啟動(dòng)子克隆及其在轉(zhuǎn)基因煙草中的活性分析[J];西北植物學(xué)報(bào);2014年05期

6 魏晶;毛偉華;林擁軍;陳浩;;1個(gè)新水稻組成型啟動(dòng)子的克隆與功能鑒定[J];華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2012年02期

7 張俊蓮;王麗;秦舒浩;司懷軍;劉玉匯;王蒂;;利用擬南芥rd29A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)AtNHX1基因提高煙草耐鹽性[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào);2011年04期

8 呂山花;孫寬瑩;樊穎倫;;擬南芥根特異表達(dá)基因啟動(dòng)子在煙草中的表達(dá)[J];西北植物學(xué)報(bào);2011年06期

9 朱顯靈;潘文杰;陳懿;陳偉;李章海;張紀(jì)利;徐增漢;李洪勛;;不同氣候條件下煙葉腺毛分泌物主要成分的差異分析[J];煙草科技;2011年01期

10 陳宗瑜;簡(jiǎn)少芬;浦衛(wèi)瓊;鐘楚;董陳文華;紀(jì)鵬;;濾減UV-B輻射對(duì)煙葉腺毛發(fā)育和密度動(dòng)態(tài)變化的影響[J];生態(tài)學(xué)雜志;2010年11期

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3 周世民;香料煙腺毛和結(jié)晶細(xì)胞發(fā)育及其與環(huán)境關(guān)系研究[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

本文編號(hào)：2579756