發(fā)布時間：2019-11-26 00:03

【摘要】：【目的】克隆陸地棉開花促進(jìn)因子家族的一個基因Flowering Promoting Factor1-like Protein 5(Gh FLP5),并對其時空表達(dá)模式進(jìn)行研究,解析其在開花調(diào)控過程中的作用,為創(chuàng)制早熟陸地棉材料奠定基礎(chǔ)。【方法】根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列,用Oligo7軟件設(shè)計引物,以中棉所50(CCRI50)的c DNA為模板,克隆獲得Gh FLP5。在Ex PASy網(wǎng)站上預(yù)測其蛋白的理化性質(zhì),同時在NCBI中檢索其他物種中的FPF蛋白,使用Clustal X2進(jìn)行多重序列比對,并用MEGA6構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹;取陸地棉早熟品種CCRI50和中晚熟品種魯棉研28(Lu28)不同生長時期、不同組織的樣品,對Gh FLP5的時間和空間表達(dá)模式進(jìn)行分析;從基因組數(shù)據(jù)庫中調(diào)取Gh FLP5起始密碼子上游1 500 bp的片段,用Plant CARE在線工具預(yù)測其順式作用元件,選取相關(guān)激素對二葉期棉花幼苗進(jìn)行葉面噴施處理,研究Gh FLP5的應(yīng)答反應(yīng);構(gòu)建植物表達(dá)載體p BI121-Gh FLP5,轉(zhuǎn)化擬南芥,觀察轉(zhuǎn)基因株系的表型,并用q RT-PCR對其內(nèi)源基因表達(dá)的變化進(jìn)行測定�！窘Y(jié)果】Gh FLP5開放閱讀框長300 bp,編碼的蛋白質(zhì)分子量為11.4 k D,共包含3個比較保守的區(qū)域,與大豆、苜蓿和毛果楊的開花促進(jìn)因子親緣關(guān)系較近。空間表達(dá)模式分析表明,Gh FLP5在葉片中優(yōu)勢表達(dá),且在早熟品種CCRI50中的表達(dá)量顯著高于晚熟品種Lu28;時間表達(dá)模式分析表明,在CCRI50中其表達(dá)量高峰出現(xiàn)在三葉期,而在Lu28中四葉期表達(dá)量最高。Gh FLP5的啟動子上主要存在兩大類順式作用元件,一類是光響應(yīng)元件和生物鐘元件,一類是脅迫響應(yīng)元件。根據(jù)順式作用元件的分布和功能選取水楊酸(SA)、脫落酸(ABA)和茉莉酸(JA)噴施處理棉花幼苗,結(jié)果表明,Gh FLP5能響應(yīng)外源SA和ABA而上調(diào),也會被外施JA抑制。組成型表達(dá)Gh FLP5的擬南芥株系抽薹時間提前約9 d,開花時間提前約7 d,蓮座葉數(shù)目減少,差異達(dá)到極顯著水平。熒光定量的結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因擬南芥中促進(jìn)開花的基因LEAFY(At LFY)、SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS(At SOC1)、FLOWERING LOCUS T(At FT)、APETALA1(At AP1)和FRUITFULL(At FUL)表達(dá)量顯著升高,抑制開花的基因Flowering Locus C(At FLC)表達(dá)量顯著降低。在轉(zhuǎn)基因擬南芥中生長素應(yīng)答基因SMALL AUXIN UPREGULATED 20(At SAUR20)和SMALL AUXIN UPREGULATED22(At SAUR22)顯著上調(diào),具有生物活性的赤霉素(GA)合成的相關(guān)基因GIBBERELLIN 20-OXIDASE 1(GA20OX1)的表達(dá)量提高2倍�！窘Y(jié)論】轉(zhuǎn)基因擬南芥早花表型明顯,Gh FLP5可能在調(diào)控中發(fā)揮了雙重作用,通過IAA和GA途徑促進(jìn)擬南芥的開花轉(zhuǎn)型。
【圖文】：

12期王聰聰?shù)龋宏懙孛揲_花相關(guān)基因GhFLP5的表達(dá)及功能分析2227圖5異源表達(dá)GhFLP5的擬南芥開花時間提前Fig.5TheArabidopsisheterelogous-expressingGhFLP5boltsandbloomsearlierthanthewildtype株系呈現(xiàn)明顯的早花表型。轉(zhuǎn)基因擬南芥在播種16d后開始抽薹，平均抽薹時間在17d左右，極顯著地低于野生型的26d。35S::GhFLP5株系的開花時間在22d左右，而野生型的開花時間為29d，差異達(dá)到極顯著水平，同時，其蓮座葉數(shù)目也顯著減少（表2）。為了深入研究異源表達(dá)GhFLP5促進(jìn)擬南芥開花的分子機(jī)制，取生長18d的擬南芥的地上部分，提取RNA，檢測擬南芥一些內(nèi)源基因的表達(dá)。在組成型表達(dá)GhFLP5的轉(zhuǎn)基因株系中，開花促進(jìn)基因LEAFY（AtLFY）、SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCONSTANS（AtSOC1）、FLOWERINGLOCUST（AtFT）、APETALA1（AtAP1）和FRUITFULL（AtFUL）的表達(dá)量都有所上調(diào)，尤其是AtAP1，表達(dá)量超過野生型中的16倍（圖6-a）。而開花抑制因子FLOWERINGLOCUSC（AtFLC）的表達(dá)則被抑制（圖6-a），這也與在擬南芥中組成型表達(dá)GhFLP5正調(diào)控開花時間的表型相符。同時，根據(jù)已有的報道對調(diào)控擬南芥開花時間的激素的生物合成酶的編碼基因進(jìn)行了檢測，包括乙烯表2野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥抽薹、開花時間及蓮座葉數(shù)目統(tǒng)計Table2Boltingtime,floweringtimeandthenumberofrosetteleavesofwildandtransgenicplants材料Materials抽薹時間Boltingtime(d)開花時間Floweringtime(d)蓮座葉數(shù)NumberofrosetteleavesWT26.05±1.3929.1±1.1710.31±0.73LR-617.95±0.95**21.85±0.67**7.22±0.56**LR-717.35±0.88**22.05±0.76**7.54±1.21**LR-917.5±1.32**21.8±1.06**7.39±0.87**LR-1019.1±1.25**22.55±0.99**7.98±0.32**

12期王聰聰?shù)龋宏懙孛揲_花相關(guān)基因GhFLP5的表達(dá)及功能分析2227圖5異源表達(dá)GhFLP5的擬南芥開花時間提前Fig.5TheArabidopsisheterelogous-expressingGhFLP5boltsandbloomsearlierthanthewildtype株系呈現(xiàn)明顯的早花表型。轉(zhuǎn)基因擬南芥在播種16d后開始抽薹，平均抽薹時間在17d左右，極顯著地低于野生型的26d。35S::GhFLP5株系的開花時間在22d左右，而野生型的開花時間為29d，差異達(dá)到極顯著水平，，同時，其蓮座葉數(shù)目也顯著減少（表2）。為了深入研究異源表達(dá)GhFLP5促進(jìn)擬南芥開花的分子機(jī)制，取生長18d的擬南芥的地上部分，提取RNA，檢測擬南芥一些內(nèi)源基因的表達(dá)。在組成型表達(dá)GhFLP5的轉(zhuǎn)基因株系中，開花促進(jìn)基因LEAFY（AtLFY）、SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCONSTANS（AtSOC1）、FLOWERINGLOCUST（AtFT）、APETALA1（AtAP1）和FRUITFULL（AtFUL）的表達(dá)量都有所上調(diào)，尤其是AtAP1，表達(dá)量超過野生型中的16倍（圖6-a）。而開花抑制因子FLOWERINGLOCUSC（AtFLC）的表達(dá)則被抑制（圖6-a），這也與在擬南芥中組成型表達(dá)GhFLP5正調(diào)控開花時間的表型相符。同時，根據(jù)已有的報道對調(diào)控擬南芥開花時間的激素的生物合成酶的編碼基因進(jìn)行了檢測，包括乙烯表2野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥抽薹、開花時間及蓮座葉數(shù)目統(tǒng)計Table2Boltingtime,floweringtimeandthenumberofrosetteleavesofwildandtransgenicplants材料Materials抽薹時間Boltingtime(d)開花時間Floweringtime(d)蓮座葉數(shù)NumberofrosetteleavesWT26.05±1.3929.1±1.1710.31±0.73LR-617.95±0.95**21.85±0.67**7.22±0.56**LR-717.35±0.88**22.05±0.76**7.54±1.21**LR-917.5±1.32**21.8±1.06**7.39±0.87**LR-1019.1±1.25**22.55±0.99**7.98±0.32**


本文編號：2565917