【摘要】：根據(jù)GenBank發(fā)布的幾丁質(zhì)酶基因的保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,采用RT-PCR和RACE技術(shù),克隆到菊花1個(gè)幾丁質(zhì)酶基因ChCHI(GenBank登錄號(hào)為KX881373)。ChCHI基因cDNA全長(zhǎng)為1 385 bp,包含960 bp開放閱讀框,編碼319個(gè)氨基酸。ChCHI屬于親水性蛋白,相對(duì)分子質(zhì)量約為35.5 k D,等電點(diǎn)為6.38,為穩(wěn)定蛋白,二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明該蛋白以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主。蛋白序列比對(duì)和進(jìn)化樹分析表明,ChCHI基因編碼的蛋白屬于糖苷水解酶19家族幾丁質(zhì)酶,與薇甘菊(ACO25187.1)幾丁質(zhì)酶蛋白的親緣關(guān)系最近,序列一致性為87%。qRT-PCR分析結(jié)果顯示,SA處理可以明顯提高貢菊葉片中ChCHI的表達(dá)量。菊花ChCHI在對(duì)抗環(huán)境脅迫的分子調(diào)控中起重要作用。
【圖文】：

物和0．1mmol·L－1SA處理葉片8h的cDNA進(jìn)行菊花幾丁質(zhì)酶基因保守片段的PCＲ擴(kuò)增，預(yù)期得到1條長(zhǎng)度約為500bp的片段，該片段大小與預(yù)期目的條帶一致，測(cè)序結(jié)果得到529bp的特異保守片段。根據(jù)該片段序列采用ＲACE技術(shù)，設(shè)計(jì)ＲACE引物，利用3’端引物GSP1和GSP2擴(kuò)增出3’端目的片段，用5’端引物GSP3和GSP4擴(kuò)增出5’端目的片段。將中間片段、3’端目的片段和5’端目的片段序列拼接，在開放閱讀框(OＲF)區(qū)域設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，得到了預(yù)期的片段，最終獲得大小為1385bp的菊花幾丁質(zhì)酶基因的全長(zhǎng)cDNA序列(圖1)。其核苷酸序列在NCBI上Blast分析，發(fā)現(xiàn)其與薇甘菊的幾丁質(zhì)酶基因有較高一致性，為83%，將該基因命名為ChCHI，提交GenBank，，登錄號(hào)為KX881373。包含1個(gè)19家族幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)域，表明該片段為幾丁質(zhì)酶片段。經(jīng)NCBI在線工具OＲFFinder軟件查找，該基因具有960bp的完整開放閱讀框，5’端非編碼區(qū)為72bp，3’端非編碼區(qū)為353bp，編碼319個(gè)氨基酸(圖2)。1．保守片段;2．5’－ＲACE;3．3’－ＲACE;4．開放閱讀框片段;M．DL2000。1．Conservedregion;2．5’－ＲACE;3．3’－ＲACE;4．OＲF;M．DL2000．圖1菊花幾丁質(zhì)酶基因的擴(kuò)增Fig．1AmplificationofchitinasegeneinChrysanthemummorifolium

第2期崔波，等:菊花幾丁質(zhì)酶基因ChCHI的克隆及表達(dá)分析221ATG．起始密碼子;TAA．終止密碼子;陰影．保守序列ATG．Startcodon;TAA．Stopcodon;Shadow．ConservedSequence圖2菊花幾丁質(zhì)酶基因核苷酸序列和推測(cè)的氨基酸序列Fig．2ThenucleotideacidsequenceanddeducedaminosequenceofchitinasegeneinChrysanthemummorifolium2．2菊花幾丁質(zhì)酶基因及編碼蛋白序列的生物信息學(xué)分析利用NCBI的蛋白保守區(qū)數(shù)據(jù)庫對(duì)菊花幾丁質(zhì)酶基因編碼蛋白的保守區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明(圖3)，該蛋白在第64－301氨基酸殘基之間有一個(gè)幾丁質(zhì)酶糖苷酶19家族結(jié)構(gòu)域，在此結(jié)構(gòu)域內(nèi)有3個(gè)催化殘基位點(diǎn)和7個(gè)糖結(jié)合位點(diǎn)，說明該結(jié)構(gòu)域包含催化區(qū);該結(jié)構(gòu)域還是一個(gè)溶菌酶相似超家族基因的保守結(jié)構(gòu)域，推測(cè)該蛋白兼具溶菌酶活性。將菊花的幾丁質(zhì)酶基因與其他植物的幾丁質(zhì)酶基因的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)(圖4)，發(fā)現(xiàn)它們有較高的同源性。一致性分析表明，ChCHI的氨基酸序列與薇甘菊(MikaniamicranthaACO25187．1)、梅(PrunusmumeXP－008222679．1)和芝麻(SesamumindicumXP－011073914．1)的一

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