擬南芥AtPAP1基因植物表達載體構建及在煙草中遺傳轉化分析
【圖文】：
?光光度計在480、649和665nm波長下測量光密度值。根據(jù)公式計算葉綠素含量。Chla含量(mg·g-1)=0.005×(12.19×OD665 3.45×OD649)/質量;Chlb含量(mg·g-1)=0.005×(21.99×OD649 5.32×OD665)/質量;Car含量(mg·g-1)=0.005×[1000×OD480 2.14×(12.19×OD665 3.45×OD649) 70.16×(21.99×OD649 5.32×OD665)]×220-1/質量。實驗結果1擬南芥AtPAP1基因的克隆及植物表達載體的構建利用TaKaRaMiniBESTPlantRNAExtractionKit試劑盒提取擬南芥花序的總RNA(圖1-A)。以反轉錄后的cDNA為模板擴增AtPAP1基因。AtPAP1基因(GenBank登錄號AY519563.1)的ORF長度為747bp,共編碼248個氨基酸,該基因編碼蛋白的分子量為28.5kDa,蛋白質的等電點為9.20。利用限制性內切酶XbaI和SacI對AtPAP1目的片段和pROKII載體進行雙酶切反應,用DNAligaseKit進行連接反應,重組載體暫命名為pROKII-圖1植物表達載體pROKII-AtPAP1的構建Fig.1TheconstructionofpROKII-AtPAP1vectorA:擬南芥花序總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖,1、2:擬南芥花序總RNA;B:植物表達載體pROKII-AtPAP1構建的凝膠電泳圖,M:DNAmarkerDL5000,1、2:AtPAP1基因的PCR擴增產物,3:pROKII-AtPAP1質粒用XbaI和SacI進行雙酶切檢測電泳圖,4~8:5個pROKII-AtPAP1重組載體的PCR產物。
1202植物生理學報AtPAP1。將連接產物轉化入大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細胞中,隨機挑取單克隆經(jīng)pROKII載體通用引物PCR驗證并提取質粒進行雙酶切檢測,最終將陽性質粒送公司測序檢測。測序結果表明,AtPAP1基因已經(jīng)重組到pROKII載體上,沒有堿基序列突變,pROKII-AtPAP1載體構建成功(圖1-B)。2pROKII-AtPAP1載體在煙草中的遺傳轉化與檢測采用葉盤轉化法,將農桿菌GV3101(pROKII-AtPAP1)侵染煙草葉片,經(jīng)過4~5周的選擇培養(yǎng),從葉片周圍的愈傷組織分化出紅色或淡紅色的抗性芽(圖2-A)。將抗性芽分離后,放在含有卡那抗生素的分化培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng),得到大量從生芽(圖2-B),待叢生芽抽莖后,移栽至生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)(圖2-C)。提取11個生長30d的轉基因煙草抗性苗葉片總RNA,利用實時熒光定量PCR檢測AtPAP1基因在不同轉基因株系中的相對表達量,結果如圖2-D。在11個株系中均有AtPAP1基因表達,基因相對表達量從高到低排序依次為:L4>L1>L9>L6>L5>L8>L11>L3>L10>L7>L2。選取相對表達量不同的的5個株系(L4、L9、L5、L11、L2)移栽至土質培養(yǎng)基中。2周后,觀察到轉基因株系呈現(xiàn)出由綠色至紫紅色的顏色變化,且與AtPAP1基因的表達量成正相關(圖2-E)。3轉基因植株形態(tài)學觀察選取表達量低(L2)、中(L5、L8和L11)和高(L1、L4和L9)的轉基因植株和野生型植株移栽到土壤,2周左右,用顯微鏡分別觀察葉片形態(tài)變化。與野生型相比,轉基因植株隨著表達量的不同均呈現(xiàn)出不同顏色差異變化,主要表現(xiàn)為葉片下表皮整體變紅、主葉脈變紅、下表皮上出現(xiàn)點狀或側葉脈變紅等,而在野生型中沒有發(fā)現(xiàn)這些變化。即AtPAP1基因表達量高的株系顏色遍布葉片整體,呈現(xiàn)出深紅色(圖3-B~D),表達量居中的株系呈現(xiàn)出淺紅色(圖3-F~H),而AtPAP1基因表達量低的株系只改變葉片局部位置
【參考文獻】
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，本文編號：2562374
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