【摘要】：以轉(zhuǎn)基因植物中常見(jiàn)的3種篩選調(diào)控元件、2種標(biāo)記基因和1種目的基因?yàn)闄z測(cè)靶標(biāo),建立了能在一次PCR擴(kuò)增中同時(shí)檢測(cè)6種轉(zhuǎn)基因成分的多重PCR檢測(cè)方法。結(jié)果表明,當(dāng)多重PCR體系中Ca MV35S啟動(dòng)子、Fa MV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、bar基因、NPTII基因、CP4-EPSPS基因的檢測(cè)引物濃度分別為0.2、0.2、0.3、0.3、0.2、0.2μmol/L,退火溫度為60℃時(shí)擴(kuò)增效果最佳,利用優(yōu)化后的六重PCR方法可從轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、棉花、油菜等各類樣品中精準(zhǔn)檢測(cè)出相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因成分,方法的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到0.1%。該方法為食品中常見(jiàn)轉(zhuǎn)基因成分的篩查提供了一種高效的手段,在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)工作中具有較高的應(yīng)用價(jià)值。
【圖文】：

15985、LLCOTTON25、轉(zhuǎn)基因油菜GT73、非轉(zhuǎn)基因植物混合物等13種植物樣品。結(jié)果顯示，利用設(shè)計(jì)的FMV35S啟動(dòng)子引物能夠從陽(yáng)性對(duì)照樣品、MON89034玉米、MON89788大豆、MON1445棉花和GT73油菜樣品中擴(kuò)增出401bp的特異性片段，利用NPTII基因引物則能從陽(yáng)性對(duì)照樣品、MON863玉米、MON531棉花、MON1445棉花和MON15985棉花樣品中獲得499bp的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，均與預(yù)期結(jié)果一致（見(jiàn)圖1和表1）。由此確定了6個(gè)檢測(cè)靶標(biāo)的擴(kuò)增引物，不同擴(kuò)增產(chǎn)物之間至少相差60bp，從理論上確保多重PCR產(chǎn)物可通過(guò)3%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行區(qū)分。圖1FMV35S啟動(dòng)子和NPTII基因檢測(cè)引物的特異性測(cè)試Fig.1SpecificityoftheprimersforFMV35SpromoterandNPTIIgene為進(jìn)一步驗(yàn)證篩選出的6對(duì)檢測(cè)引物（表2）在單一PCR和多重PCR中的適用性，以非轉(zhuǎn)基因植物混合物的DNA樣品為稀釋劑，將陽(yáng)性對(duì)照樣品DNA溶液稀釋至每個(gè)轉(zhuǎn)化體組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為1%，進(jìn)行單一PCR和多重PCR測(cè)試。結(jié)果如圖2所示，以6對(duì)引物分別進(jìn)行單一PCR擴(kuò)增時(shí)，均能從陽(yáng)性對(duì)照樣品中特異性地?cái)U(kuò)增出對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)基因成分，而將6對(duì)引物放在同一PCR管中進(jìn)行六重PCR擴(kuò)增時(shí)，可從陽(yáng)性對(duì)照樣品中擴(kuò)增到6種預(yù)期的轉(zhuǎn)基因成分，且在電泳圖譜中能夠清晰識(shí)別出每一種檢測(cè)靶標(biāo)的特異性條帶，表明這6對(duì)引物適用于構(gòu)建多重PCR檢測(cè)體系。圖2引物適用性測(cè)試Fig.2ApplicabilityoftheprimersforsingletandmultiplexPCRassays2.2六重PCR的擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序優(yōu)化由于每種轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)引物的擴(kuò)增效率和退火溫度不盡相同，為保證每對(duì)引物在多重PCR體系中均能正常工作，盡可能降低引物間的交互抑制，并確保建立的多重PCR方法滿足一定的檢測(cè)靈敏度，需對(duì)每種檢測(cè)靶標(biāo)的引物用量和退火溫度進(jìn)行梯度測(cè)試[12]。為此，將陽(yáng)性對(duì)

獲得499bp的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，均與預(yù)期結(jié)果一致（見(jiàn)圖1和表1）。由此確定了6個(gè)檢測(cè)靶標(biāo)的擴(kuò)增引物，不同擴(kuò)增產(chǎn)物之間至少相差60bp，從理論上確保多重PCR產(chǎn)物可通過(guò)3%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行區(qū)分。圖1FMV35S啟動(dòng)子和NPTII基因檢測(cè)引物的特異性測(cè)試Fig.1SpecificityoftheprimersforFMV35SpromoterandNPTIIgene為進(jìn)一步驗(yàn)證篩選出的6對(duì)檢測(cè)引物（表2）在單一PCR和多重PCR中的適用性，以非轉(zhuǎn)基因植物混合物的DNA樣品為稀釋劑，將陽(yáng)性對(duì)照樣品DNA溶液稀釋至每個(gè)轉(zhuǎn)化體組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為1%，進(jìn)行單一PCR和多重PCR測(cè)試。結(jié)果如圖2所示，以6對(duì)引物分別進(jìn)行單一PCR擴(kuò)增時(shí)，，均能從陽(yáng)性對(duì)照樣品中特異性地?cái)U(kuò)增出對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)基因成分，而將6對(duì)引物放在同一PCR管中進(jìn)行六重PCR擴(kuò)增時(shí)，可從陽(yáng)性對(duì)照樣品中擴(kuò)增到6種預(yù)期的轉(zhuǎn)基因成分，且在電泳圖譜中能夠清晰識(shí)別出每一種檢測(cè)靶標(biāo)的特異性條帶，表明這6對(duì)引物適用于構(gòu)建多重PCR檢測(cè)體系。圖2引物適用性測(cè)試Fig.2ApplicabilityoftheprimersforsingletandmultiplexPCRassays2.2六重PCR的擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序優(yōu)化由于每種轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)引物的擴(kuò)增效率和退火溫度不盡相同，為保證每對(duì)引物在多重PCR體系中均能正常工作，盡可能降低引物間的交互抑制，并確保建立的多重PCR方法滿足一定的檢測(cè)靈敏度，需對(duì)每種檢測(cè)靶標(biāo)的引物用量和退火溫度進(jìn)行梯度測(cè)試[12]。為此，將陽(yáng)性對(duì)照樣品DNA用非轉(zhuǎn)基因植物混合物的DNA稀釋成每個(gè)轉(zhuǎn)化體組分分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%和0.1%的測(cè)試樣品，設(shè)置CaMV35S啟動(dòng)子、FMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、bar基因、NPTII基因、CP4-EPSPS基因的引物終濃度比為0.2∶0.2∶0.2∶0.2∶0.2∶0.2、0.2∶0.2∶0.25∶0.25∶0.2∶0.2、0.2∶0.2∶0.3∶0.3∶0.2∶0.2等3種組合，退火溫度為58、6
【作者單位】： 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院;
【基金】：國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)課題(2014ZX08012-001) 吉林省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目(2013-2016)
【分類號(hào)】：TS207.3

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本文編號(hào)：2552893