【摘要】：石磺科貝類(lèi)是在海水、淡水、陸地都有分布的一類(lèi)生物,它們的生活區(qū)域分布于淺海、灘涂潮間帶甚至潮上帶,生活環(huán)境具有典型的兩棲性,其皮膚呼吸能力的強(qiáng)弱、肌肉的結(jié)構(gòu)、角質(zhì)層的形成和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育程度因生活環(huán)境的不同表現(xiàn)出明顯的生物適應(yīng)性,因此石磺科貝類(lèi)又被認(rèn)為是海洋無(wú)脊椎動(dòng)物從水生到陸生進(jìn)化的過(guò)渡類(lèi)群。為探究肌肉在石磺由海洋向陸地進(jìn)化過(guò)程中發(fā)揮作用的分子機(jī)制,探討其在該過(guò)程中產(chǎn)生的適應(yīng)性進(jìn)化,本論文以我國(guó)分布廣泛且研究較為深入的4種石磺作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,以已有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ),比較分析后篩選、克隆了石磺肌肉相關(guān)基因,分析在不同種石磺、各組織中的表達(dá)狀態(tài),并對(duì)4種石磺進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了初步探討。(1)采用RACE方法從瘤背石磺(Onchidium struma)肌肉中首次克隆到MSTN cDNA的全長(zhǎng)并做了相應(yīng)的組織表達(dá)分析。研究結(jié)果表明瘤背石磺MSTN基因cDNA全長(zhǎng)2667bp,5′-非翻譯區(qū)(5′-UTC)的長(zhǎng)度為374bp,3′端非翻譯區(qū)(3′-UTC)的長(zhǎng)度為643bp,1650bp的開(kāi)放閱讀框(ORF),對(duì)應(yīng)編碼549個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)該基因編碼的蛋白質(zhì)原子總量為8776,分子式為C2774H4331N783O862S26,分子質(zhì)量約為63.27kD,理論等電點(diǎn)為6.02,信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示MSTN蛋白N端具有21個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的信號(hào)肽。瘤背石磺MSTN具有MSTN的共同特征,包括蛋白酶水解位點(diǎn)RSRR和C端多肽生物活性區(qū)以及9個(gè)保守的半胱氨酸殘基。系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析結(jié)果顯示瘤背石磺MSTN與加州海兔MSTN的親緣關(guān)系最近。RT-PCR結(jié)果顯示,MSTN基因在各個(gè)組織中均有表達(dá);含肌纖維組織中的表達(dá)量低于內(nèi)臟器官的表達(dá)量,在瘤背石磺肝胰腺中的表達(dá)量最高,瘤背石磺腹足中表達(dá)量最低(P0.05)。(2)以石磺科4種貝類(lèi)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),瘤背石磺(Onchidium struma)、里氏擬石磺(Paraoncidium reevesii)、平疣桑椹石磺(Platevindex mortoni)、紫色疣石磺(Peronia verruculata)為實(shí)驗(yàn)材料克隆了4種石磺的MyHC基因的編碼區(qū)全長(zhǎng)并進(jìn)行了分析,結(jié)果表明瘤背石磺MyHC基因cDNA全長(zhǎng)7566bp,開(kāi)放閱讀框?yàn)?895bp,對(duì)應(yīng)編碼1964個(gè)氨基酸,同時(shí)包括228bp的5’端非翻譯區(qū),1443bp的3’端非翻譯區(qū)。預(yù)測(cè)瘤背石磺MyHC基因編碼的蛋白質(zhì)由31713個(gè)原子組成,分子式為C9765H15897N2849O3150S52,相對(duì)分子量約為225.28kD,理論等電點(diǎn)為5.56,信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果表明瘤背石磺MyHC蛋白N端具有29個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的信號(hào)肽。瘤背石磺MyHC具有兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域MYSc_class_Ⅱ和Myosin_tail_l,且親水性氨基酸集中在Myosin_tail_l。里氏擬石磺MyHC的cDNA全長(zhǎng)7598bp,包括5904bp的開(kāi)放閱讀框,對(duì)應(yīng)編碼1967個(gè)氨基酸,276bp的5′端非翻譯區(qū),1418bp的3′端非翻譯區(qū),預(yù)測(cè)編碼蛋白原子總量31713,分子式為C9765H15894N2860O3156S56;平疣桑椹石磺MyHC的cDNA全長(zhǎng)7115bp,預(yù)測(cè)開(kāi)放閱讀框?yàn)?904bp,預(yù)測(cè)編碼1967個(gè)氨基酸,5′-UTC為165bp,3′-UTC為1046bp,預(yù)測(cè)編碼蛋白原子總量31776,分子式為C9785H15921N2865O3153S52;紫色疣石磺MyHC的cDNA全長(zhǎng)7115bp,預(yù)測(cè)ORF為5904bp,對(duì)應(yīng)編碼1967個(gè)氨基酸,192bp的5′-UTC,1059bp的3′-UTC,預(yù)測(cè)編碼蛋白原子總量31730,分子式為C9762H15895N2859O3157S57。石磺科貝類(lèi)MyHC具有兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域MYSc_class_Ⅱ和Myosin_tail_l,且親水性氨基酸集中在Myosin_tail_l。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)深入研究石磺肌球蛋白重鏈基因的原位雜交實(shí)驗(yàn)、western blot檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。(3)為探究石磺科貝類(lèi)肌肉相關(guān)基因在各組織中的表達(dá)差異,分別取瘤背石磺的背部皮膚、腹部皮膚、腹足、肺囊、肝胰腺、口球、兩性腺、蛋白腺8個(gè)組織以及里氏擬石磺、平疣桑椹石磺、紫色疣石磺的背部皮膚、腹部皮膚、腹足、肺囊4個(gè)組織進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。MyHC基因在4種石磺不同組織中的熒光定量結(jié)果顯示:背部皮膚中,瘤背石磺的表達(dá)量最高,里氏擬石磺表達(dá)量最低,且表達(dá)差異顯著;腹部皮膚中,平疣桑椹石磺表達(dá)量最高;腹足中平疣桑椹石磺表達(dá)量最高,瘤背石磺次之,里氏擬石磺表達(dá)量最低,表現(xiàn)出顯著差異;肺囊中整體表達(dá)量低,瘤背石磺表達(dá)量最高,未出現(xiàn)顯著性差異。瘤背石磺MSTN、MyHC基因在瘤背石磺8個(gè)組織中均檢測(cè)到表達(dá),且大致上呈現(xiàn)一種負(fù)相關(guān)的關(guān)系,從而間接證明MSTN基因?qū)yHC的表達(dá)具有一定的負(fù)調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為今后研究石磺科貝類(lèi)肌肉生長(zhǎng)發(fā)育及其調(diào)節(jié)機(jī)理打下了基礎(chǔ),對(duì)進(jìn)一步研究石磺科肌肉相關(guān)基因進(jìn)行原核表達(dá)及多克隆抗體的制備具有參考意義,更為深入探討海洋無(wú)脊椎動(dòng)物從水生向陸生適應(yīng)性進(jìn)化的研究提供了分子依據(jù)。
【圖文】：

圖 2-1 瘤背石磺 MSTN cDNA 序列和推測(cè)的氨基酸序列下劃線(xiàn)表示信號(hào)肽序列，雙下劃線(xiàn)表示 TGF-β 結(jié)構(gòu)域，波浪線(xiàn)表示 AATAAA加尾信號(hào)和 Poly(A)尾巴。方框內(nèi)表示蛋白酶水解位點(diǎn)，陰影部分為保守的半胱氨酸殘基Fig. 2-1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of O.struma MSTNThe UTR and ORF regions are shown in lowercase and uppercase letters, respectively;underline is thededuced signal peptide;TGF-beta domain is double underlined;The putative eukaryotic polyadenylationsignal(AATAAA) and polyadenylation signal is shown in wavy line; The proteolytic processing site(RKKR) is boxed;the shadow is The conserved cysteine residues (Cys).

圖 2-2 預(yù)測(cè)的瘤背石磺 MSTN 三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig. 2-2 MSTN in O.struma tertiary structure predicte析背石磺 MSTN 的進(jìn)化地位，使用 MrBayes-3.2.6 和 MEGA6.0 構(gòu)的 19 個(gè)物種 22 條 MSTN 序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（前者為 MrBayesA6.0 數(shù)據(jù)）。進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物分為兩支的 MSTN 聚類(lèi)成一個(gè)分支，然后與光滑雙臍螺聚在一起，櫛孔聚在一起，，隨后這兩個(gè)分支又與美洲地蟹（Gecarcinus laterali魚(yú)的 MSTN 聚在一起，人（Homo sapiens）和黑猩猩（Pan tro一個(gè)獨(dú)立的分支（圖 2.3）。將瘤背石磺 MSTN 氨基酸序列與其 氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在 TGF-β 結(jié)構(gòu)域各個(gè)物種氨基表 2.2 其他物種 MSTN的 NCBI登錄號(hào)
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2552586