【摘要】：主要探討了在黑麥草屬植物中導入高羊茅S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因(FaSAMDC)對轉基因植株抗旱耐熱性的提高效果,為培育黑麥草抗旱耐熱新品種提供種質新材料。選擇黑麥草成熟種子為外植體,采用貴州省草業(yè)研究所分子生物學實驗室構建的過表達載體以及黑麥草胚性愈傷組織高頻植株再生和農桿菌介導的遺傳轉化體系,將克隆自高羊茅的FaSAMDC基因轉入貴州地區(qū)主栽品種多花黑麥草特高和多年生黑麥草四季的基因組內,經抗性篩選、PCR檢測和Southern雜交分析驗證,獲得45株特高與44株四季的轉基因植株,轉化頻率分別為2.93%和2.28%�？购的蜔嵩囼灡砻�,在30℃高溫和中度干旱脅迫條件下,特高轉基因株系的根冠比比對照組培苗高出7.08%,葉片相對含水量(RWC)比對照高出13.12%,RWC降低幅度比對照少5.49個百分點;四季轉基因株系的根冠比比對照組培苗高出6.54%,RWC比對照高出12.54%,RWC降低幅度比對照少6.50個百分點,差異均達到顯著水平(P0.05),證明轉入FaSAMDC基因的黑麥草陽性株系的抗旱耐熱能力得到了明顯提高。形態(tài)與生長特征觀測結果顯示,與非轉基因組培苗相比,轉基因株系的葉長、株高、主莖節(jié)數減小,葉寬、單株分蘗數增加,葉色變深,植株形狀趨向于葉片叢生的緊湊型,推測導入的FaSAMDC基因參與了基因表達、細胞分裂等生理功能的調節(jié)。
【圖文】：

的轉基因植株。1材料與方法1．1材料黑麥草外植體選用在貴州地區(qū)種植較為普遍的品種的成熟種子，一年生黑麥草特高于2014年購于貴陽霖卉園林綠化有限公司，多年生黑麥草四季由貴州省草業(yè)研究所保存。2013至2014年構建的過表達載體是由經貴州省草業(yè)研究所分子生物學實驗室改造過的植物表達載體pCAMBIA1300與克隆自高羊茅黔草1號的SAMDC基因(FaSAMDC)所形成的重組質粒pCAMBIA1300-FaSAMDC。該載體具有潮霉素(hygromycin，Hyg)和卡那霉素(kanamycin，Kan)抗性，在FaSAMDC片段的兩側各具有一個CaMV35S啟動子，主要表達框架如圖1所示。通過凍融法將重組質粒導入根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA105和GV3101中，經PCＲ和酶切驗證獲得陽性克�。�14］。圖1構建的過表達載體結構圖Fig．1SchematicicdiagramofconstructedrecombinantplasmidLB:左邊界Leftborder;CaMVpoly(A):來自花椰菜花葉病毒35S啟動子的多聚腺苷酸尾Polyadenylationfrom35Spromoterofcauliflowermosaicvirus;HYG:抗潮霉素序列Hygromycinresistantsequence;XhoI:限制性內切酶XhoI識別序列SequencerecognizedbyrestrictionenzymeXhoI;CaMV35Spromot-er1:來自花椰菜花葉病毒的35S啟動子135Spromoter1fromcauliflowermosaicvirus;EcoＲI:限制性內切酶EcoＲI識別序列Sequencerecognizedbyre-strictionenzymeEcoＲI;NsiI:限制性內切酶NsiI識別序列SequencerecognizedbyrestrictionenzymeNsiI;SphI:限制性內切酶SphI識別序列Sequencerec-ognizedbyrestrictionenzymeSphI;PstI:限制性內切酶PstI識別序列SequencerecognizedbyrestrictionenzymePstI;FaSAMDC:插入的高羊茅腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因InsertedS-adenosylmethioninedecarboxylasegenefromFestucaarundinacea;

中特高轉基因株系比對照苗高出7．08%，四季轉基因株系比對照高出6．54%，，差異均達到顯著水平(P＜0．05)。圖2農桿菌介導的黑麥草遺傳轉化及植株再生Fig．2Agrobacterium-mediatedtransformationofryegrassandregenerationofthetransformedplantletsA:誘導出的特高胚性愈傷組織;B:特高胚性愈傷組織與根癌農桿菌的共培養(yǎng);C:四季抗性愈傷組織不定芽的分化;D:生根培養(yǎng)基中特高和四季抗性植株生根;E:特高和四季抗性植株移栽至花缽并成活;F:特高和四季抗性植株在人工氣候室內生長。A:InducedembryogeniccallusofTetragold;B:Co-cultureofembryogeniccallusofTetragoldandAgrobacteriumtumefaciens;C:DifferentiationofadventitiousbudsfromresistantcallusofFourseasons;D:Hygromycin-resistantplantsofTetragoldandFourseasonsgrowinginrootingmedium;E:Hygromycin-resistantplantsofTetragoldandFourseasonspottedinsoilsuccessfully;F:Hygromycin-resistantplantsofTetragoldandFourseasonsgrowinginclimaticlaboratory．圖3轉基因黑麥草抗性植株潮霉素B基因的PCＲ檢測Fig．3PCＲanalysisofBgeneofhygromycininputativetransgenicplantsofryegrassM:DNA分子量;+:EHA105-p1300菌(陽性對照);－:非轉化植株(陰性對照);1～9:特高和四季轉基因抗性植株。M:DNAmarker;+:StrainEHA105-p1300aspositivecontrol;－:Non-transformedplantasnegativecontrol;1－9:Transgenichygromycin-resistantplantsofTetragoldandFoursea-sons．表1農桿菌介導2個黑麥草品種的轉化頻率Table1TransgenicfrequencyoftworyegrasscultivarsbyAgrobacteriumtumefaciens特高Tetragold轉化愈傷組織數No．ofcallitransformed抗性?
【作者單位】： 貴州省農業(yè)科學院草業(yè)研究所;
【基金】：貴州省農業(yè)科技攻關項目(黔科合NY[2013]3060號) 貴州省農業(yè)科學院博士科研啟動基金(2013-06) 黔農科院自主創(chuàng)新科研專項[(2014)010號] 貴州省高層次創(chuàng)新型人才培養(yǎng)項目(黔科合人才[2016]4024) 貴州省科技創(chuàng)新人才團隊建設項目(黔科合平臺人才[2016]5617)資助
【分類號】：S543.6

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本文編號：2548627