【摘要】：研究背景及目的:結(jié)腸癌(colon cancer)是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,我國(guó)結(jié)腸癌的發(fā)病率逐年上升。結(jié)腸癌的治療一般以手術(shù)治療為主,并配合化學(xué)治療以及靶向治療,但患者尤其是晚期結(jié)腸癌患者的生存及預(yù)后不甚理想。中醫(yī)藥在結(jié)腸癌的治療中具有一定療效,可以通過(guò)降低結(jié)腸癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移機(jī)率,改善患者的生存質(zhì)量,但臨床治療效果個(gè)體差異較大,作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步明確。在前期研究中發(fā)現(xiàn),中藥提取物貝母素乙(peiminine)在體外實(shí)驗(yàn)中能夠明顯抑制人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞生長(zhǎng),因此,本研究擬繼續(xù)研究貝母素乙對(duì)人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響,并觀察貝母素乙對(duì)人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞自噬的作用,明確該單體對(duì)人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞的分子作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制,為該藥物的開(kāi)發(fā)及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。研究方法:1.采用Affymetrix公司的PrimeView?Human Gene Expression Array基因表達(dá)譜芯片探究中藥提取物貝母素乙對(duì)人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響。將實(shí)驗(yàn)分為貝母素乙組和對(duì)照組,分別干預(yù)人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞后,提取總RNA,隨后基因芯片雜交步驟按照北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司提供的基因表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)操作流程進(jìn)行,并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。2.將穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3的質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染至人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞,用不同濃度(0uM、50uM、100uM、200uM)的貝母素乙作用該細(xì)胞,對(duì)照組用相同體積的DMSO處理,使用共聚焦顯微鏡觀察自噬現(xiàn)象;將不同處理的貝母素乙作用HCT-116細(xì)胞,即5個(gè)給藥濃度(0 uM,50uM,100uM,200 uM,400uM)和五個(gè)給藥時(shí)長(zhǎng)(0小時(shí),4小時(shí),8小時(shí),12小時(shí),24小時(shí)),蛋白免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。研究結(jié)果:1.篩選出37個(gè)差異基因,貝母素乙組和對(duì)照組比較,顯著上調(diào)5個(gè),下調(diào)32個(gè)。經(jīng)過(guò)GO(Go Ontology)富集分析,差異基因主要集中在生物學(xué)過(guò)程和分子功能方面,而在細(xì)胞組分方面無(wú)明顯差異;在生物學(xué)過(guò)程中差異基因主要集中在熱生成調(diào)控、運(yùn)動(dòng)行為調(diào)控、尿嘧啶核苷代謝過(guò)程、腎上腺素能受體信號(hào)通路的調(diào)控、脂肪組織代謝的調(diào)控和G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路的調(diào)控;在分子功能方面表現(xiàn)為腎上腺素能受體結(jié)合活性和尿嘧啶核苷磷酸化酶活性。經(jīng)過(guò)KEGG富集分析,差異表達(dá)基因主要集中在藥物代謝酶、嘧啶代謝、酮體合成和降解、維生素B6代謝、核糖體方面。2.在共聚焦顯微鏡下,可以明顯觀察到貝母素乙組中多個(gè)明亮的綠色熒光斑點(diǎn)聚集成團(tuán)塊狀,形成自噬斑,而對(duì)照組呈散點(diǎn)狀分布,且隨著貝母素乙濃度的升高,自噬細(xì)胞數(shù)量逐漸增多。蛋白免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè),與對(duì)照組相比,200 uM和400uM的貝母素乙以及200 uM的貝母素乙處理細(xì)胞不同時(shí)長(zhǎng)(4小時(shí),8小時(shí),12小時(shí),24小時(shí)),LC3B-II/LC3B-I比值及SQSTM1(p62)均成顯著升高的趨勢(shì)(p0.05)。結(jié)論:從基因?qū)用娴慕Y(jié)果提示差異表達(dá)基因有37個(gè),這些基因的變化均可能是貝母素乙抗腫瘤作用的靶點(diǎn),主要體現(xiàn)在對(duì)細(xì)胞增殖、氟尿嘧啶代謝通路的影響、能量代謝、對(duì)YY1轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控四個(gè)方面。其中YY1基因的上調(diào),共聚焦顯微鏡觀察到自噬斑,蛋白免疫印跡法檢測(cè)到自噬蛋白LC3B-II、SQSTM1(p62)的表達(dá),均提示貝母素乙對(duì)人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞的作用與自噬相關(guān),有利于貝母素乙藥理活性的深入研究,為浙貝母抗腫瘤的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
【圖文】：

圖 1 兩組細(xì)胞差異基因表達(dá)比較散點(diǎn)圖因芯片檢測(cè)后的數(shù)據(jù)結(jié)果據(jù)對(duì)貝母素乙組和對(duì)照組樣本進(jìn)行 PrimeView Human Gene E測(cè)的結(jié)果顯示：依照篩選標(biāo)準(zhǔn)選出差異基因 37 個(gè)，，顯著上調(diào)

共聚焦顯微鏡觀察不同溶度的貝母素乙誘導(dǎo)HCT-116細(xì)胞自噬斑的形成
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.35

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2546415