【摘要】：目的:檢測食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell cancer,ESCC)組織標(biāo)本及細(xì)胞株中β-環(huán)連蛋白抑制基因1(dishevelled-binding antagonist of beta-catenin 1,DACT1)Cp G島旁區(qū)域及轉(zhuǎn)錄起始點(transcription start site,TSS)區(qū)域的甲基化狀態(tài),并進(jìn)一步探討DACT1基因兩個不同區(qū)域甲基化狀態(tài)對基因轉(zhuǎn)錄及預(yù)后的影響。方法:應(yīng)用甲基化特異性PCR(methylation specific PCR,MSP)及RT-PCR的方法檢測ESCC細(xì)胞株(TE1、TE13、T.Tn和Eca109)及河北省上消化道腫瘤高發(fā)區(qū)159例ESCC患者癌及相應(yīng)癌旁組織中DACT1基因兩個不同區(qū)域的甲基化狀態(tài)及m RNA的表達(dá)情況。結(jié)果:DACT1基因在4株ESCC細(xì)胞系中均呈弱表達(dá)或陰性表達(dá)。應(yīng)用甲基化抑制劑5-Aza-Dc處理該細(xì)胞株后,DACT1 m RNA表達(dá)明顯增強(qiáng);同時,MSP檢測結(jié)果顯示,此兩區(qū)域的甲基化條帶均明顯減弱或消失;而應(yīng)用組蛋白去乙酰化酶抑制劑TSA處理細(xì)胞株后,該基因在各細(xì)胞株中的表達(dá)無明顯改變。DACT1 m RNA在ESCC組織中的表達(dá)較癌旁組織明顯下調(diào)(P0.01),且與該基因TSS區(qū)域異常甲基化狀態(tài)有關(guān)(P0.01);DACT1基因Cp G島旁區(qū)域的甲基化頻率在癌及相應(yīng)癌旁組織中均較高(P0.05),不具有腫瘤組織特異性,且對DACT1基因的轉(zhuǎn)錄抑制無明顯影響(P0.05);生存分析顯示,DACT1基因TSS區(qū)域的甲基化狀態(tài)與ESCC癌患者的生存期相關(guān)(P0.01)。結(jié)論:ESCC中DACT1基因TSS區(qū)域的異常高甲基化狀態(tài)是引起其表達(dá)下調(diào)的機(jī)制之一,并有望作為ESCC患者預(yù)后的甲基化標(biāo)志物。
【圖文】：

異常甲基化對食管癌患者預(yù)后的影響島旁區(qū)域，即位于CpG島邊緣CpG位點密度相對較低的區(qū)域（region1：-540~-419bp）和環(huán)繞轉(zhuǎn)錄起始點TSS區(qū)域（region2：-16~105bp）（圖1）甲基化。MSP引物序列及PCR條件見表1。MSP法檢測ESCC及癌旁組織和食管癌細(xì)胞株的DACT1基因甲基化狀態(tài)。SssI處理基因組DNA作為甲基化陽性對照（M-PC)組，無消化系統(tǒng)及其他系統(tǒng)腫瘤的正常人外周血DNA作為非甲基化陽性對照(N-PC)組，，滅菌雙蒸水取代DNA模板進(jìn)行PCR作為陰性對照(NC)組。隨機(jī)選取10%標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)實驗。+1:Thetranscriptionstartpoint圖1DACT1基因啟動子區(qū)CpG島分布圖Fig.1DistributionoftheCpGislandsinpromoterofDACT1gene1.5RT-PCR方法檢測DACT1mRNA表達(dá)按TRIzol試劑盒說明書提取組織及細(xì)胞株總RNA，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于檢測DACT1mRNA的表達(dá)。GAPDH作為內(nèi)參照，所用引物及退火溫度見表1。PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，利用圖像分析系統(tǒng)Gelwork-2ID對mRNA進(jìn)行定量。1.6免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)方法檢測DACT1蛋白表達(dá)應(yīng)用常規(guī)SP法。石蠟切片常規(guī)脫蠟，梯度乙醇水化。3%甲醇過氧化氫封閉后用EDTA高壓修復(fù)2~5min，血清封閉，DACT1抗體孵育過夜，再依次加入生物素化二抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的三抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。以PBS代替一抗做空白對照。以胞漿內(nèi)出現(xiàn)均勻一致的棕黃色顆粒視為陽性表達(dá)，并依據(jù)傳統(tǒng)的染色評分方法[7]對結(jié)果進(jìn)行判定。1.7統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件。各組間甲基化頻率差異分析用χ2檢驗；mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)用表示，差異比較用t檢驗；用Log-rank檢驗分析DACT1基因CpG島旁區(qū)域和TSS區(qū)域甲基化狀態(tài)對ESCC患者生存期的影響。P<0.05或P<0.01表示差?

異常甲基化對食管癌患者預(yù)后的影響島旁區(qū)域，即位于CpG島邊緣CpG位點密度相對較低的區(qū)域（region1：-540~-419bp）和環(huán)繞轉(zhuǎn)錄起始點TSS區(qū)域（region2：-16~105bp）（圖1）甲基化。MSP引物序列及PCR條件見表1。MSP法檢測ESCC及癌旁組織和食管癌細(xì)胞株的DACT1基因甲基化狀態(tài)。SssI處理基因組DNA作為甲基化陽性對照（M-PC)組，無消化系統(tǒng)及其他系統(tǒng)腫瘤的正常人外周血DNA作為非甲基化陽性對照(N-PC)組，滅菌雙蒸水取代DNA模板進(jìn)行PCR作為陰性對照(NC)組。隨機(jī)選取10%標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)實驗。+1:Thetranscriptionstartpoint圖1DACT1基因啟動子區(qū)CpG島分布圖Fig.1DistributionoftheCpGislandsinpromoterofDACT1gene1.5RT-PCR方法檢測DACT1mRNA表達(dá)按TRIzol試劑盒說明書提取組織及細(xì)胞株總RNA，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于檢測DACT1mRNA的表達(dá)。GAPDH作為內(nèi)參照，所用引物及退火溫度見表1。PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，利用圖像分析系統(tǒng)Gelwork-2ID對mRNA進(jìn)行定量。1.6免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)方法檢測DACT1蛋白表達(dá)應(yīng)用常規(guī)SP法。石蠟切片常規(guī)脫蠟，梯度乙醇水化。3%甲醇過氧化氫封閉后用EDTA高壓修復(fù)2~5min，血清封閉，DACT1抗體孵育過夜，再依次加入生物素化二抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的三抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。以PBS代替一抗做空白對照。以胞漿內(nèi)出現(xiàn)均勻一致的棕黃色顆粒視為陽性表達(dá)，并依據(jù)傳統(tǒng)的染色評分方法[7]對結(jié)果進(jìn)行判定。1.7統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件。各組間甲基化頻率差異分析用χ2檢驗；mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)用表示，差異比較用t檢驗；用Log-rank檢驗分析DACT1基因CpG島旁區(qū)域和TSS區(qū)域甲基化狀態(tài)對ESCC患者生存期的影響。P<0.05或P<0.01表示差?
【作者單位】： 河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院河北省腫瘤研究所病理研究室;
【基金】：國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81472335,No.81572441) 河北省自然科學(xué)基金資助項目(No.H2013206315)~~
【分類號】：R735.1

【參考文獻(xiàn)】

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【共引文獻(xiàn)】

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【二級參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2543332