【摘要】：水稻稻瘟病抗性新基因OsAAA1是一種誘導(dǎo)型的廣譜抗病基因,但OsAAA1的表達(dá)模式及調(diào)控機(jī)理未知。為了研究OsAAA1的表達(dá)模式及調(diào)控機(jī)理,通過(guò)對(duì)OsAAA1啟動(dòng)子序列的生物信息學(xué)分析,克隆了3個(gè)OsAAA1啟動(dòng)子區(qū)域的缺失體,將上述缺失體轉(zhuǎn)入植物雙元表達(dá)載體DX2181G中。通過(guò)菌落PCR、質(zhì)粒PCR檢測(cè)和質(zhì)粒DNA酶切鑒定并測(cè)序確認(rèn),結(jié)果表明以上3個(gè)啟動(dòng)子系列缺失載體構(gòu)建成功。為進(jìn)一步研究OsAAA1啟動(dòng)子的表達(dá)模式及該基因的調(diào)控機(jī)理提供了參考依據(jù)。
【圖文】：

克隆質(zhì)粒均切出了載體帶和目的帶，為陽(yáng)性質(zhì)粒(圖4)。菌落PCR和質(zhì)粒酶切鑒定為陽(yáng)性的克隆經(jīng)Sanger測(cè)序正確后保存，，綜合以上結(jié)果表明OsAAA1啟動(dòng)子缺失系列片段載體構(gòu)建成功。2討論本研究成功構(gòu)建了3個(gè)啟動(dòng)子缺失系列載體，下一步是將成功構(gòu)建的載體進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)基因植株陽(yáng)性鑒定后，進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色和GUS酶活熒光定量分析來(lái)研究OsAAA1啟動(dòng)子的表達(dá)模式和OsAAA1基因的調(diào)控機(jī)制。通過(guò)對(duì)OsAAA1啟動(dòng)子序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子含有多種與植物抗病性有關(guān)的順式作用元圖2啟動(dòng)子缺失片段P0重組載體菌落PCR鑒定注:M:DL15000DNAmarker;1~3:P0Figure2ColonyPCRidentificationofrecombinantvectorofpro-moterdeletionfragmentP0Note:M:DL15000DNAmarker;1~3:P0圖3啟動(dòng)子缺失片段P1和P2重組載體菌落PCR鑒定注:M:DL2000DNAmarker;1~3:P2;4~6:P1Figure3ColonyPCRidentificationofrecombinantvectorofpro-moterdeletionfragmentP1andP2Note:M:DL2000DNAmarker;1~3:P2;4~6:P1圖1OsAAA1基因啟動(dòng)子缺失片段的PCR擴(kuò)增注:M1:DL2000marker;M2:DL15000marker;1~3:P0,P1,P2Figure1PCRamplificationofOsAAA1genepromoterdeletionfragmentsNote:M1:DL2000marker;M2:DL15000marker;1~3:P0,P1,P22908

表達(dá)載體DX2181G，以期研究OsAAA1基因的表達(dá)模式，為進(jìn)一步闡釋該基因的調(diào)控機(jī)理提供了參考依據(jù)。1結(jié)果與分析1.1OsAAA1啟動(dòng)子缺失片段的克隆以日本晴基因組DNA為模板擴(kuò)增OsAAA1啟動(dòng)子區(qū)域的缺失體P0、P1、P2(圖1)，其大小分別為2893bp、1099bp、506bp。PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，目的條帶大小與預(yù)期一致，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。1.2菌落PCR檢測(cè)將克隆到的目的片段回收后與載體DX2181G質(zhì)粒DNA連接，挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示擴(kuò)增得到的目的帶大小依次為2893bp、1099bp、506bp(圖2;圖3)。P0片段重組載體3個(gè)單克隆均擴(kuò)出目的帶，P2片段重組載體3個(gè)單克隆有2個(gè)擴(kuò)出目的片段，P1片段重組載體3個(gè)單克隆均擴(kuò)出目的片段。1.3質(zhì)粒酶切檢測(cè)將菌落PCR檢測(cè)到的陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA，用SalⅠ酶進(jìn)行酶切檢測(cè)，P0挑取了3個(gè)單克隆質(zhì)粒，P1、P2均挑取2個(gè)單克隆質(zhì)粒，結(jié)果顯示：以上7個(gè)單克隆質(zhì)粒均切出了載體帶和目的帶，為陽(yáng)性質(zhì)粒(圖4)。菌落PCR和質(zhì)粒酶切鑒定為陽(yáng)性的克隆經(jīng)Sanger測(cè)序正確后保存，綜合以上結(jié)果表明OsAAA1啟動(dòng)子缺失系列片段載體構(gòu)建成功。2討論本研究成功構(gòu)建了3個(gè)啟動(dòng)子缺失系列載體，下一步是將成功構(gòu)建的載體進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)基因植株陽(yáng)性鑒定后，進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色和GUS酶活熒光定量分析來(lái)研究OsAAA1啟動(dòng)子的表達(dá)模式和OsAAA1基因的調(diào)控機(jī)制。通過(guò)對(duì)OsAAA1啟動(dòng)子序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子含有多種與植物抗病性有關(guān)的順式作用元圖2啟動(dòng)子缺失片段P0重組載體菌落PCR鑒定注:M:DL15000DNAmarker;1~3:P0Figure2ColonyPCRidentificationofrecombinantvectorofpro-moterdeletionfragm
【作者單位】： 中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生物技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：國(guó)家轉(zhuǎn)基因重大專項(xiàng)(2014ZX0800904B) 國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31370306)共同資助
【分類號(hào)】：Q943.2;S511

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2 李志新;曹雙河;張相岐;張懷剛;;偽鵝觀草高分子量麥谷蛋白基因啟動(dòng)子的克隆[J];長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版)農(nóng)學(xué)卷;2007年02期

3 高剛;魯艷芹;韓金祥;趙麗;;雙啟動(dòng)子對(duì)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白表達(dá)的影響[J];中國(guó)生物制品學(xué)雜志;2009年10期

4 郝迪

本文編號(hào)：2540879