【摘要】：植物中最大的一類(lèi)抗病基因(R)編碼的蛋白質(zhì)含有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)(coiled-coil,CC)、核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(nucleotide-binding site,NBS)和富含亮氨基酸的重復(fù)序列(leucine-rich repeat,LRR)結(jié)構(gòu)域。R基因以抗病著稱(chēng)。文章通過(guò)酵母雙雜篩選方式獲得了DDI3基因,該基因與番茄中重要功能基因DDB1具有相互作用,而又含有CC-NBS-LRR結(jié)構(gòu),預(yù)測(cè)具有R基因抗病性,參與植物抗病。研究中構(gòu)建了DDI3過(guò)表達(dá)載體并通過(guò)根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到野生型番茄中,篩選獲得DDI3高表達(dá)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系。通過(guò)病菌接種實(shí)驗(yàn),觀察植株發(fā)病情況和統(tǒng)計(jì)細(xì)菌菌落數(shù),結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因植株的抗病性明顯高于野生型番茄。DDI3基因?qū)μ岣叻训目共⌒杂泻芨叩膬r(jià)值,為采用基因工程方法改良番茄植株抗病性做出新的嘗試,同時(shí)又與番茄DDB1基因具有相互作用,對(duì)研究DDB1基因在參與植物抗病途徑中的功能研究提供新的方向。
【圖文】：

基因與測(cè)序以番茄ｃＤＮＡ為模板，用ＤＤＩ３－Ｆ１和ＤＤＩ３－Ｒ１為外側(cè)引物ＰＣＲ擴(kuò)增。再以ＰＣＲ產(chǎn)物為模板，以ＤＤＩ３－Ｆ２和ＤＤＩ３－Ｒ２為內(nèi)側(cè)引物擴(kuò)增，產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果如圖１所示，圖１中，，擴(kuò)增產(chǎn)物為一條特異條帶，與預(yù)期的番茄ＤＤＩ３基因片段２５１１ｂｐ大小一致。將其連接到ｐＥＡＳＹ－Ｂｌｕｎｔ載體上，酶切鑒定正確，送測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用ＤＮＡＭＡＮ和Ｃｈｒｏｍａｓ軟件分析序列，與番茄ＤＤＩ３基因在番茄基因組中序列一致。圖１ＤＤＩ３基因ＰＣＲ擴(kuò)增２．２表達(dá)載體鑒定用ＳｍａⅠ和ＸｈｏⅠ進(jìn)行雙酶切得到與預(yù)期結(jié)果大小一致２５１１ｂｐ的ＤＤＩ３基因片段，證明ＤＤＩ３基因已經(jīng)連接到植物表達(dá)載體３５Ｓ－ｐＢＩ１２１上，如圖２所示。圖２ｐＢＩ１２１－３５Ｓ－ＤＤＩ３載體雙酶切鑒定結(jié)果２．３轉(zhuǎn)基因植株的鑒定植物組織培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因番茄株系，從葉片中提取轉(zhuǎn)基因植株基因組ＤＮＡ，利用植物表達(dá)載體ｐＢＩ１２１攜帶的ＮＰＴⅡ基因?qū)χ仓赀M(jìn)行陽(yáng)性鑒定，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為８５７ｂｐ。共得到組培苗１２株，其中６株經(jīng)過(guò)鑒定為轉(zhuǎn)基因番茄苗，結(jié)果如圖３所示。圖３表明，負(fù)對(duì)照野生型植株ＤＮＡ未能擴(kuò)增出８５７ｂｐ條帶，而正對(duì)照３５Ｓ－ｐＢＩ１２１質(zhì)粒和轉(zhuǎn)基因株系ＤＮＡ擴(kuò)增出８５７ｂｐ條帶，說(shuō)明攜帶ＮＰＴⅡ基因的載體片段已整合于受體植株核染色體組中。圖３轉(zhuǎn)基因番茄植株的ＰＣＲ鑒定２．４轉(zhuǎn)基因植株的表型ＤＤＩ３轉(zhuǎn)基因植株與野生型生長(zhǎng)狀況相比，沒(méi)有明顯差異，轉(zhuǎn)基因植株果實(shí)顏色在成熟時(shí)期與

一條特異條帶，與預(yù)期的番茄ＤＤＩ３基因片段２５１１ｂｐ大小一致。將其連接到ｐＥＡＳＹ－Ｂｌｕｎｔ載體上，酶切鑒定正確，送測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用ＤＮＡＭＡＮ和Ｃｈｒｏｍａｓ軟件分析序列，與番茄ＤＤＩ３基因在番茄基因組中序列一致。圖１ＤＤＩ３基因ＰＣＲ擴(kuò)增２．２表達(dá)載體鑒定用ＳｍａⅠ和ＸｈｏⅠ進(jìn)行雙酶切得到與預(yù)期結(jié)果大小一致２５１１ｂｐ的ＤＤＩ３基因片段，證明ＤＤＩ３基因已經(jīng)連接到植物表達(dá)載體３５Ｓ－ｐＢＩ１２１上，如圖２所示。圖２ｐＢＩ１２１－３５Ｓ－ＤＤＩ３載體雙酶切鑒定結(jié)果２．３轉(zhuǎn)基因植株的鑒定植物組織培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因番茄株系，從葉片中提取轉(zhuǎn)基因植株基因組ＤＮＡ，利用植物表達(dá)載體ｐＢＩ１２１攜帶的ＮＰＴⅡ基因?qū)χ仓赀M(jìn)行陽(yáng)性鑒定，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為８５７ｂｐ。共得到組培苗１２株，其中６株經(jīng)過(guò)鑒定為轉(zhuǎn)基因番茄苗，結(jié)果如圖３所示。圖３表明，負(fù)對(duì)照野生型植株ＤＮＡ未能擴(kuò)增出８５７ｂｐ條帶，而正對(duì)照３５Ｓ－ｐＢＩ１２１質(zhì)粒和轉(zhuǎn)基因株系ＤＮＡ擴(kuò)增出８５７ｂｐ條帶，說(shuō)明攜帶ＮＰＴⅡ基因的載體片段已整合于受體植株核染色體組中。圖３轉(zhuǎn)基因番茄植株的ＰＣＲ鑒定２．４轉(zhuǎn)基因植株的表型ＤＤＩ３轉(zhuǎn)基因植株與野生型生長(zhǎng)狀況相比，沒(méi)有明顯差異，轉(zhuǎn)基因植株果實(shí)顏色在成熟時(shí)期與野生型植株果實(shí)基本一致，雖然具有抗病ＣＣ－ＮＢＳ－ＬＲＲ結(jié)構(gòu)，但未能改變番茄的表型性狀。發(fā)苗實(shí)驗(yàn)中，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，可以觀察到相同生長(zhǎng)期內(nèi)ＤＤＩ３轉(zhuǎn)基因種子萌發(fā)速率要慢于野生型ＡＣ番茄種子。２．５接種Ｐｓｔ．ＤＣ３０００
【作者單位】： 合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院;
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31171179)
【分類(lèi)號(hào)】：Q943.2;S436.412

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本文編號(hào)：2535517