【摘要】：三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)是我國最主要的淡水珍珠貝。在珍珠養(yǎng)殖過程中,外套膜小片移植手術,即插片手術,是十分重要的技術環(huán)節(jié)。插片手術后,經過一系列的免疫反應,外套膜小片形成珍珠囊,珍珠在珍珠囊里形成。同時,手術也會對育珠貝造成很大的傷害,甚至會因為感染而死亡。如何采取有效管理措施緩解外套膜小片與育珠貝間免疫排斥反應,降低插片手術以后育珠貝受細菌等病原微生物感染率,成為提高珍珠質量和產量的重要課題。目前,外套膜小片移植手術后,育珠貝和外套膜小片的免疫生理過程仍不清楚。免疫基因的表達變化可反映免疫生理過程,具有指示作用。凝集素是重要的模式識別受體可識別多種病原微生物及其他異物,調控后續(xù)系列免疫反應。本研究從三角帆蚌體內鑒定出了2個半乳糖凝集素基因(Galectin),對它們的結構和功能進行了全面而系統(tǒng)的研究,并分析了2個基因在育珠移植免疫過程中的指示作用,揭示了生理反應關鍵點,以期為育珠生產過程中及時采取有效處理措施提供理論依據。得到了以下研究結果:1.兩個半乳糖凝集素基因的cDNA全長序列的克隆及結構分析我們克隆獲得2個半乳糖凝集素基因,分別命名為HcGal1和HcGal2。HcGal1基因的cDNA序列全長為1917 bp,其中包括140bp的5’端非翻譯區(qū)(UTR),838bp的3’端非翻譯區(qū),以及939 bp的開放閱讀框,編碼了312個氨基酸。包含2個CRD。預測HcGal1的蛋白分子量和理論等電點分別為35.5kDa和9.54,沒有信號肽。HcGal2基因的cDNA序列全長為797 bp,包括80 bp的5’端UTR,267 bp的3’端UTR,以及450 bp的開放閱讀框,編碼149個氨基酸。包含1個CRD。預測的蛋白分子量和理論等電點分別為17.2kDa和7.82,沒有信號肽。2.兩個半乳糖凝集素基因組織表達分析熒光定量PCR檢測發(fā)現,2個基因的mRNA在三角帆蚌各個組織中都有表達,其中HcGal1在血細胞中表達最高,血液是三角帆蚌重要的免疫組織,而HcGal1基因在血細胞中的高表達可以初步推測其發(fā)揮著重要的免疫作用。HcGal2在外套膜中的表達量最高,外套膜是貝類免疫的第一道防線,這也表明HcGal2發(fā)揮著重要的免疫作用。Western blot分析表明,2個基因在蛋白水平的表達與mRNA的表達不一致,推測是由于mRNA的轉錄后調控造成,即機體會根據自身的需要以降解的方式清除不需要表達的mRNA,或者是通過改變mRNA的半衰期等來控制基因表達的程度以及蛋白產物的生產。3.兩個半乳糖凝集素基因細菌誘導后的相應表達2個基因在血細胞、外套膜、肝臟經革蘭氏陰性菌、陽性菌刺激后均呈現顯著性上調的趨勢,表明HcGal1和HcGal2可以起到抑菌、殺菌的作用,從而達到清除病原菌的目的。并且HcGal1和HcGal2在不同組織中對于不同細菌的效應時間有所不同,說明HcGal1和HcGal2在不同的組織中對于每種細菌的敏感度是有所不同的,原因可能是由于兩個基因的CRD結構域的不同,使得它們對不同細菌表面的糖類的識別與結合能力有所不同。4.兩個半乳糖凝集素基因蛋白水平的功能研究原核表達出了2個基因的重組蛋白,細菌凝集實驗顯示2個基因的蛋白均能夠凝集一些菌種,表明2個基因均能夠識別并且抵御病原微生物的入侵。將2個基因的重組蛋白注射到蚌體后,檢測血細胞對異物的吞噬效率,結果顯示注射了重組蛋白的血細胞吞噬效率比對照組顯著性地增強,表明2個基因的重組蛋白能夠促進血細胞的吞噬作用,從而殺死病原菌。5.育珠移植免疫生理過程指示作用研究插片手術以后,2個基因在被檢測的各個組織中呈現了不同的表達模式,推測HcGal2基因對于“非己”物質有強烈的免疫排斥反應。而HcGal1基因則可能是參與了機體的負反饋調節(jié),通過降低mRNA水平減小機體對異物的排斥而使移植小片不脫落。另外,根據基因的表達變化以及對珍珠囊形成過程的肉眼觀察,可將插核后移植免疫分為3個關鍵生理期,即靜歇期(0-24 h),傷口愈合和珍珠囊形成期(24 h-7 d)和珍珠形成期(7天以后)。通過基因在這幾個時期的表達變化,可以在我們生產上起到生理指示作用,研究免疫基因的表達與插片手術后機體的生理反應之間的關系,及時的對養(yǎng)殖環(huán)境做出調整,以降低蚌體的感染率和脫片率,提高成活率和珍珠質量。
【圖文】：

16圖 2-1A：三角帆蚌 HcGal1 基因的核苷酸和氨基酸序列。方框里為兩個糖識別結構域，下劃為多聚腺苷酸信號 AATAAA，GenBank 登錄號為 KX064397。Fig 2-1A: Nucleotide and deduced amino acid sequences of the Hyriopsis cumingii galecPredicted carbohydrate recognition domains are shown as boxes and the predicted polyadenyla

signal AATAAA is underlined. The GenBank accession number of the H. cumingii galectin isKX064397.圖2-1B: SMART軟件分析HcGal1的結構域，包括CRD1（10-155氨基酸殘基）和CRD（2193-311氨基酸殘基）。Fig 2-1B:The predicted conserved carbohydrate recognition domain CRD1 (residues10-155) andCRD2 (residues193-311) of HcGal1 obtained from SMART.HcGal2 基因的 cDNA 序列全長為 797 bp，包括 80bp 的 5’端 UTR，267 bp 的3’端 UTR，以及 450 bp 的開放閱讀框，編碼 149 個氨基酸（Genebank 登錄號：KY404092）。HcGal1 的氨基酸序列中包括 1 個 CRD：氨基酸殘基 9-140。預測的蛋白分子量和理論等電點分別為 17.2kDa 和 7.82，，沒有信號肽。
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4

【參考文獻】

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本文編號：2525331