發(fā)布時間：2019-07-26 09:32

【摘要】：利用免疫細胞熒光、RNA干涉(RNA interfere,RNAi)、qRT-PCR、Western blot及細胞計數(shù)等方法,設(shè)計合成三對小分子干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)(siRNA-hnRNP K-1,2,3),對小鼠精原細胞中內(nèi)源性的不均一性核糖核蛋白K(Heterogeneous ribonucleoproteins K,hnRNP K)進行敲低并對其沉默效率進行篩選,研究其對小鼠精原細胞存活的影響.結(jié)果表明,siRNA-hnRNP K-3對小鼠精原細胞具有80%以上的沉默效率,轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)細胞數(shù)目明顯減少,說明沉默hnRNP K基因的表達對小鼠精原細胞的存活有顯著影響.
【圖文】：

轉(zhuǎn)膜（６０Ｖ，２ｈ），脫脂奶粉封閉２ｈ，４℃一抗孵育過夜，二抗室溫孵育２ｈ，最后使用ＥＣＬ發(fā)光試劑盒在化學發(fā)光成像系統(tǒng)中自動顯色成像．２結(jié)果與分析２．１ｈｎＲＮＰＫ在小鼠精原細胞中的表達通過免疫細胞熒光技術(shù)檢測ｈｎＲＮＰＫ在ＧＣ－１ｓｐｇ細胞的表達及定位，結(jié)果顯示帶有紅色熒光標記信號的ｈｎＲＮＰＫ與細胞核著色的ＤＡＰＩ藍色熒光信號強烈且均勻，二者完全重合，如圖１，表明ｈｎＲＮＰＫ主要在ＧＣ－１ｓｐｇ的細胞核中具有強表達．圖１ｈｎＲＮＰＫ在ＧＣ－１ｓｐｇ細胞中的表達Ｆｉｇ．１ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｈｎＲＮＰＫｉｎＧＣ－１ｓｐｇｃｅｌｌ２．２ｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ干擾效率篩選由以上免疫細胞熒光的結(jié)果可知，ｈｎＲＮＰＫ在ＧＣ－１ｓｐｇ細胞核中高表達，提示其可能對精原細胞存活發(fā)揮作用．于是設(shè)計合成３對ｈｎＲＮＰＫ的干擾序列（ｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ－１，２，３）及１對陰性對照序列（ｓｉＲＮＡ－ＮＣ）（見表１）．轉(zhuǎn)染ＧＣ－１ｓｐｇ細胞設(shè)置ｓｉＲＮＡ轉(zhuǎn)染組（ｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ－１、２、３）、陰性對照組（ｓｉＲＮＡ－ＮＣ）及空白對照組（Ｍｏｃｋ）三個組別，４８ｈ后，通過ｑＲＴ－ＰＣＲ檢測干擾效率．結(jié)果表明：與對照組ｓｉＲＮＡ－ＮＣ及Ｍｏｃｋ相比３對ｓｉＲ－ＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ均產(chǎn)生５０％以上的干擾效率，其中ｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ－３干擾效率在８０％以上，效果最好（見圖２）．于是選擇ｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ－３進行下一步的實驗．

圖２ｑＲＴ－ＰＣＲ篩選ｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ干擾效果Ｆｉｇ．２ｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｅｆｆｅｃｔｓｓｃｒｅｅｎｅｄｂｙｑＲＴ－ＰＣＲ．注：帶有不同小寫字母表示基因表達水平差異顯著（ｐ＜０．０５）進一步用胰酶將其消化成單細胞進行細胞計數(shù)，結(jié)果如表２所示，表明轉(zhuǎn)染４８ｈ后，與對照組相比較，ｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ－３轉(zhuǎn)染組細胞數(shù)目顯著低于對照組（Ｐ＜０．０５），且兩個對照組之間差異不顯著（Ｐ＞０．０５）．表２ｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ－３轉(zhuǎn)染ＧＣ－１ｓｐｇ４８ｈ后細胞計數(shù)Ｔａｂ．２ＧＣ－１ｓｐｇｃｅｌｌｃｏｕｎｔｉｎｇａｆｔｅｒｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ－３ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｆｏｒ４８ｈ組別接種細胞數(shù)目轉(zhuǎn)染４８ｈ后細胞數(shù)目ｓｉＲＮＡ－ＮＣ６×１０４３．８３±０．１２×１０５ａＭｏｃｋ６×１０４３．８０±０．１１×１０５ａｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ－３６×１０４１．５７±０．０６×１０５ｂ注：帶有不同小寫字母表示基因表達水平差異顯著（ｐ＜０．０５）利用ｑＲＴ－ＰＣＲ和ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ技術(shù)分別從ＲＮＡ及蛋白質(zhì)角度檢測ｓｉＲＮＡ對ｈｎＲＮＰＫ的沉默效果，結(jié)果檢測干擾效率均達到８０％以上（見圖４），可見ＧＣ－１ｓｐｇ內(nèi)源性的ｈｎＲＮＰＫ被成功抑制．圖３ｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ－３轉(zhuǎn)染４８ｈ后ＧＣ－１ｓｐｇ的細胞表型Ｆｉｇ．３ＧＣ－１ｓｐｇｃｅｌｌｐｈｅｎｏｔｙｐｅａｆｔｅｒｓｉＲＮＡ－ｈｎＲＮＰＫ－３ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒ４８ｈＡ．ｑＲＴ－ＰＣＲ檢測干擾效
【作者單位】： 信陽師范學院生命科學學院;
【基金】：國家自然科學基金項目(U1204326) 河南省青年骨干教師資助計劃項目(2015GGJS-139) 河南省高等學校重點科研項目(18B230011)
【分類號】：Q132.1;Q78

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本文編號：2519482