發(fā)布時(shí)間：2019-06-08 14:20

【摘要】：上皮性卵巢癌一直是婦科惡性腫瘤中致死率最高的一類腫瘤,被認(rèn)為是一個(gè)“沉默殺手”。它起病隱匿、進(jìn)展迅速,70%以上的患者在診斷時(shí)已處于晚期,腫瘤已發(fā)生廣泛盆腹腔或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,5年生存率僅有30%。所以,尋找早期診斷及早期治療方法,一直是婦科臨床醫(yī)生與婦科腫瘤基礎(chǔ)研究者多年來的工作重點(diǎn)。當(dāng)前,上皮性卵巢癌的治療為手術(shù)治療輔助以鉑類藥物為基礎(chǔ)的化療,但是,現(xiàn)有的治療方法未能取得滿意效果,由于化療耐藥而導(dǎo)致的卵巢癌治療失敗成為難以克服的問題。因此,尋找卵巢癌治療新途徑十分必要。近期,越來越多的學(xué)者把目光投向基因治療,作為一種新興的治療方法,基因治療為上皮性卵巢癌患者帶來了希望。隨著人類對(duì)上皮性卵巢癌增殖、轉(zhuǎn)移相關(guān)分子機(jī)制研究的不斷深入,上皮性卵巢癌的基因治療和細(xì)胞移植免疫治療已成為該領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn)。目前已有越來越多的學(xué)者嘗試采用不同的研究方法,應(yīng)用不同的研究途徑對(duì)腫瘤的靶向性治療進(jìn)行廣泛深入的研究與探索,一些研究已在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中取得了相當(dāng)大的進(jìn)展,甚至一些腫瘤的基因治療和細(xì)胞移植免疫治療策略已經(jīng)進(jìn)入臨床應(yīng)用階段。但基因治療和細(xì)胞移植免疫治療方法作為腫瘤治療的新手段仍有待于進(jìn)一步成熟,需要進(jìn)一步深入的研究與探索。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是近期研究發(fā)現(xiàn)的一種具有自我更新和多向分化潛能的原始細(xì)胞。目前很多研究發(fā)現(xiàn),MSCs具有腫瘤組織趨向性,可以作為腫瘤靶向治療的載體細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn),人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)不會(huì)促進(jìn)實(shí)體腫瘤的生長和浸潤,在腫瘤治療中更為安全。hUCMSCs不僅可作為腫瘤靶向治療的載體,還可通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)途徑發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。白細(xì)胞介素21 (interleukin-21, IL-21)是具有多種生物學(xué)功能的重要免疫調(diào)節(jié)因子,能介導(dǎo)固有性免疫向適應(yīng)性免疫轉(zhuǎn)換,參與體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。IL-21能夠促進(jìn)臍血祖細(xì)胞轉(zhuǎn)化為NK細(xì)胞,促進(jìn)B、T細(xì)胞增殖,并使其對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性增加。越來越多的研究已經(jīng)證實(shí)IL-21細(xì)胞因子在抗腫瘤治療中具備強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)潛能。細(xì)胞基因修飾在基因治療中一直為人們所關(guān)注,并將逐步成為治療多種疾病的一種重要手段。因此,我們將IL-21構(gòu)建于含有增強(qiáng)綠色熒光蛋白的慢病毒載體pHAGE-CMV-MCS-IZsGreen上,將重組慢病毒體pHAGE-IL-21用于基因修飾的治療性實(shí)驗(yàn)中,并對(duì)其效應(yīng)機(jī)制進(jìn)行了初探。microRNA(miRNA)是近期發(fā)現(xiàn)的一類非編碼小分子RNA,通常在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。miR-200 家族(miR-141、miR-429、miR-200a、miR-200b、miR-200c)是新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNA,系列研究發(fā)現(xiàn)它們能夠通過調(diào)控上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌中存在miR-200c表達(dá)異常,miR-200c表達(dá)下調(diào)可能與卵巢癌進(jìn)展相關(guān),并且可能是卵巢癌的不良預(yù)后因素之一。目前,卵巢癌的基因治療仍大部分停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段,在進(jìn)入臨床應(yīng)用前尚有諸多需要解決的問題,譬如:如何選擇更有效的目的基因;如何使得帶有治療作用的重組載體高效率地轉(zhuǎn)移,并長期穩(wěn)定地高表達(dá)基因產(chǎn)物;怎樣有效地將基因治療與其它治療方法聯(lián)合應(yīng)用等�；趯�(duì)以上問題的考慮,設(shè)計(jì)了本研究課題,即采用慢病毒攜帶IL-21基因轉(zhuǎn)導(dǎo)hUCMSCs,并聯(lián)合miR-200c共同發(fā)揮抗卵巢癌作用。1.目的本研究旨在將基因治療和細(xì)胞移植治療相結(jié)合,采用慢病毒攜帶IL-21基因轉(zhuǎn)染hUCMSCs,通過hUCMSCs將具有抗腫瘤效應(yīng)的IL-21細(xì)胞因子攜帶到腫瘤部位,使hUCMSCs、IL-21與miR-200c三者聯(lián)合共同發(fā)揮抗卵巢癌的作用,并探討和分析其可能的作用機(jī)制,以期為臨床使用miR-200c聯(lián)合hUCMSCs-IL-21基因治療卵巢癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。2.方法2. 1構(gòu)建含IL-21基因的重組質(zhì)粒pHAGE-IL-21,并對(duì)其進(jìn)行鑒定。隨后以重組質(zhì)粒包裝慢病毒,并對(duì)其進(jìn)行鑒定,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。2.2原代培養(yǎng)hUCMSCs,并通過表面分子標(biāo)記及成骨、成脂實(shí)驗(yàn)鑒定hUCMSCs特性。2.3重組慢病毒pHAGE-IL-21轉(zhuǎn)導(dǎo)hUCMSCs,檢測轉(zhuǎn)導(dǎo)后的hUCMSCs中IL-21的表達(dá)及活性。2.4體外實(shí)驗(yàn):1) miR-200c mimic轉(zhuǎn)染SKOV3并鑒定;2)細(xì)胞隔離共培養(yǎng):將需要共培養(yǎng)的細(xì)胞分別接種于“Trans-well”體系中,分七組進(jìn)行實(shí)驗(yàn):培養(yǎng)液對(duì)照組、hUCMSCs組、未插入IL-21基因片段的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)hUCMSCs(hUCMSCs-LV-Vec)組、插入IL-21基因片段的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)hUCMSCs (hUCMSCs-LV-IL-21)組、miR-200c 組、hUCMSCs-LV-IL-21 聯(lián)合 miR-200c 組和順鉑(DDP)組;3) MTT法測定各組上室內(nèi)細(xì)胞增殖情況;4)劃痕試驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力;5) Transwell小室基質(zhì)膠侵襲試驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲力。2.5建立人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3裸鼠移植瘤模型,成瘤后將荷瘤裸鼠分七組進(jìn)行后續(xù)治療實(shí)驗(yàn):生理鹽水對(duì)照組、hUCMSCs組、hUCMSCs-LV-Vec組、hUCMSCs-LV-IL-21 組、miR-200c 組、hUCMSCs-LV-IL-21 聯(lián)合 miR-200c 組和順鉑組。經(jīng)治療后觀察移植瘤大小、腫瘤病理及裸鼠臟器情況;取裸鼠外周血檢測血常規(guī)及肝腎功能,初步評(píng)價(jià)hUCMSCs、慢病毒、IL-21及miR-200c用于裸鼠移植瘤治療的安全性;取裸鼠外周血檢測IFN-丫、TNF-α及IL-21水平;實(shí)時(shí)定量PCR法檢測腫瘤組織中NKG2D、MIC A表達(dá)情況;免疫組化及Western blotting法檢測腫瘤組織中β-atatenin,cycylin-D1,E-鈣粘蛋白,ZEB1,Glil和Gli2表達(dá)情況。3.結(jié)果3.1構(gòu)建重組質(zhì)粒pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen-IL-2,經(jīng)酶切及測序鑒定,結(jié)果表明重組質(zhì)粒 pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen-IL-21 構(gòu)建成功,命名為 pHAGE-IL-21。pHAGE-IL-21、psPAX2、pMD2. G三種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞,24 h后在熒光顯微鏡下可以觀察到綠色熒光蛋白表達(dá),48小時(shí)后可見多量綠色熒光蛋白表達(dá)。用收獲的慢病毒在24孔板內(nèi)感染293T細(xì)胞,感染48h后在熒光顯微鏡下能夠觀察到熒光,慢病毒的滴度為1.0×109TU/ml,證實(shí)慢病毒包裝成功,重組IL-21慢病毒和空載體慢病毒分別命名為LV-IL-21和LV-Vec。3.2成功分離培養(yǎng)hUCMSCs,原代培養(yǎng)至第三代的hUCMSCs經(jīng)FCM鑒定,CD34(-)、CD45(-)、CD29 (+)、CD90 (+),符合 hUCMSCs 的細(xì)胞表型。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21天時(shí),茜素紅染色可見染成橘紅色的結(jié)節(jié)狀或顆粒狀物,呈陽性反應(yīng)。成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)21天時(shí),油紅染色提示細(xì)胞胞漿內(nèi)充滿紅色脂肪油滴,呈陽性反應(yīng)。3.3 LV-IL-21及LV-Vec分別轉(zhuǎn)導(dǎo)傳代后狀態(tài)較好的hUCMSCs ,嘌呤霉素篩選,分別得到轉(zhuǎn)導(dǎo) LV-IL-21 的 hUCMSCs (hUCMSCs-LV-IL-21)和轉(zhuǎn)導(dǎo) LV-Vec 的hUCMSCs (hUCMSCs-LV-Vec)。經(jīng)脾細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)證實(shí),hUCMSCs-LV-IL-21 表達(dá)的IL-21具有生物學(xué)活性。3.4 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1) RT-PCR證實(shí)miR-200c mimic轉(zhuǎn)入SKOV3中。(2) MTT法檢測發(fā)現(xiàn)在第4、6、8天時(shí),hUCMSCs-LV-IL-21聯(lián)合miR-200c組細(xì)胞增殖速度明顯下降,與其它6組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其余6組細(xì)胞增殖速度比較結(jié)果如下:DDP組 miR-200c組 hUCMSCs-LV-IL-21 組= hUCMSCs組= hUCMSCs-LV-Vec組對(duì)照組(“”表示結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05), “=”表示結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05) )。(3)劃痕試驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)接種24、72h hUCMSCs-LV-IL-21聯(lián)合miR-200c組細(xì)胞裂隙閉合度明顯降低,與其它六組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。hUCMSCs組、hUCMSCs-LV-Vec組及hUCMSCs-LV-IL-21 組細(xì)胞裂隙閉合度較對(duì)照組下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),而這三組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。miR-200c組裂隙閉合度低于hUCMSCs組、hUCMSCs-LV-Vec組及hUCMSCs-LV-IL-21 組(p0.05),但高于DDP組(p0.05)。(4)Transwel l小室檢測發(fā)現(xiàn)hUCMSCs-LV-IL-21聯(lián)合miR-200c組中SKOV3細(xì)胞侵襲能力明顯降低,與其它六組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。hUCMSCs組、hUCMSCs-LV-Vec組及hUCMSCs-LV-IL-21組細(xì)胞侵襲能力較對(duì)照組下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),而這三組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。miR-200c 組 SKOV3 細(xì)胞侵襲能力低于 hUCMSCs 組、hUCMSCs-LV-Vec 組及 hUCMSCs-LV-IL-21 組(p0.05),但高于DDP組(p0. 05)。3.5動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:(1)7個(gè)治療組對(duì)卵巢癌裸鼠移植瘤的抑制作用強(qiáng)弱依次為hUCMSCs-LV-IL-21 聯(lián)合miR-200c組順鉑組 miR-200c組=hUCMSCs-LV-IL-21 組hUCMSCs組=hUCMSCs-LV-Vec組生理鹽水對(duì)照組。(2)各組裸鼠的血常規(guī)指標(biāo)(紅細(xì)胞總數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、血小板數(shù)(PLT)、白細(xì)胞總數(shù)(WBC)、中性粒細(xì)胞比例(N%))及血液生化指標(biāo)(血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、葡萄糖(GLU)、尿素氮(BUN)、肌酐(CR)、甘油三脂(TG)、總膽固醇(CHOL)、乳酸脫氫酶(LDH)和堿性磷酸酶(ALP))均無明顯差異(p0.05)。 (3)治療4周后,hUCMSCs-LV-IL-21 組及hUCMSCs-LV-IL-21 聯(lián)合miR-200c組裸鼠血清中 IFN-γ、IL-21和TNF-α的含量均明顯高于其它組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*p0.05/**p 0.01)。(4)hUCMSCs-LV-IL-21 組與生理鹽水對(duì)照組及hUCMSCs-LV-IL-Vec組比較,裸鼠脾細(xì)胞體外殺傷靶細(xì)胞YAC-1和SKOV3活性顯著增強(qiáng)(P0.01)。(5)生理鹽水對(duì)照組腫瘤細(xì)胞生長活躍并伴有明顯核分裂象;hUCMSCs組、hUCMSCs-LV-Vec組腫瘤組織中可見單核細(xì)胞浸潤,并見少量腫瘤組織出血壞死;hUCMSCs-LV-IL-21組、miR-200c組及順鉑組腫瘤組織單核細(xì)胞浸潤明顯,腫瘤組織出血壞死程度重于前三組;而以hUCMSCs-LV-IL-21聯(lián)合miR-200c組腫瘤組織出血壞死程度最嚴(yán)重,并伴有大量單核細(xì)胞浸潤。(6)對(duì)處死后裸鼠的肺、肝、胃及脾組織進(jìn)行的常規(guī)切片HE染色病理分析,結(jié)果各組器官外觀均未見異常,均未發(fā)現(xiàn)這些組織有卵巢癌轉(zhuǎn)移征象或者腫瘤生成,病理切片顯示正常。(7)免疫組化及Western blotting法檢測各治療組腫瘤組織中β-catenin、cyclin-Dl、ZEB1、E-鈣粘蛋白、Glil 和Gli2表達(dá)結(jié)果顯示:1) β-catenin表達(dá):除對(duì)照組外,其它6組腫瘤組織中β-catenin的表達(dá)均有不同程度下降,其中hUCMSCs-LV-IL-21聯(lián)合miR-200c組腫瘤組織中β-catenin表達(dá)明顯下降,與其它各組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2) Cyclin-D1表達(dá):除對(duì)照組外,其它6組腫瘤組織中Cyclin-Dl的表達(dá)亦有不同程度下降,其中hUCMSCs-LV-IL-21聯(lián)合miR-200c組腫瘤組織中Cyclin-D1表達(dá)下降最為顯著,與其它各組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3) ZEB1及E-鈣粘蛋白表達(dá):hUCMSCs組、hUCMSCs-LV-Vec組、hUCMSCs-LV-IL-21 組、miR-200c組、hUCMSCs-LV-IL-21聯(lián)合miR-200c組均可觀察到ZEB1表達(dá)減少及E-鈣粘蛋白表達(dá)增加,其中hUCMSCs-LV-IL-21聯(lián)合miR-200c組上述變化最明顯,與其它各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4) Glil和Gli2表達(dá):hUCMSCs組、hUCMSCs-LV-Vec組、hUCMSCs-LV-IL-21 組、miR-200c組、hUCMSCs-LV-IL-21 聯(lián)合miR-200c組均可觀察到Glil和Gli2表達(dá)減少,其中hUCMSCs-LV-IL-21聯(lián)合miR-200c組上述變化最明顯,與其它各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(8)熒光定量PCR結(jié)果提示生理鹽水對(duì)照組、hUCMSCs組、hUCMSCs-LV-Vec組、miR-200c組腫瘤組織中MIC A及NKG2D表達(dá)均無明顯升高,順鉑組腫瘤組織中MIC A及NKG2D表達(dá)較前述4組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(MIC A, p0.01; NKG2D, p0.05)。而hUCMSCs-LV-IL-21 組及 hUCMSCs-LV-IL-21 聯(lián)合miR-200c 組腫瘤組織中 MIC A及NKG2D表達(dá)明顯增高,與順鉑組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(MIC A, p0.05;NKG2D,p0.01)。hUCMSCs-LV-IL-21 組與hUCMSCs-LV-IL-21 聯(lián)合miR-200c組間比較,腫瘤組織中MIC A及NKG2D表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。4.結(jié)論(1)從臍帶中可成功分離培養(yǎng)獲得hUCMSCs。攜帶IL-21的慢病毒可有效感染hUCMSCs。(2)慢病毒-IL-21感染的hUCMSCs能誘導(dǎo)IFN-γ、TNF-α分泌增加,促使NK細(xì)胞數(shù)量和活性增加,從而發(fā)揮良好的抗裸鼠卵巢癌移植瘤作用。該結(jié)果為臨床使用hUCMSCs為載體的基因治療卵巢癌研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。(3) hUCMSCs-LV-IL-21聯(lián)合miR-200c在體內(nèi)外均有良好的抗卵巢癌作用,其機(jī)制可能為:1) IL-21激活NK細(xì)胞,上調(diào)腫瘤組織中MIC A及NKG2D表達(dá)水平,提高裸鼠血清中IFN-γ、TNF-α含量,發(fā)揮殺傷卵巢癌細(xì)胞作用;2)hUCMSCs 及 miR-200c 下調(diào)腫瘤組織中 β-catenin、cyclin-D1、ZEB1、Glil 和Gli2表達(dá),上調(diào)E-鈣粘蛋白表達(dá),發(fā)揮抑制卵巢癌生長與轉(zhuǎn)移的作用。該研究結(jié)果為卵巢癌的治療提供了新的策略和方法。
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【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.31

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2495351