【摘要】：梨腐爛病是我國梨樹上的一種重要的枝干病害,在北方梨產區(qū)發(fā)病嚴重的梨園常造成大量死樹或毀園,病菌侵染梨樹后導致細胞壁降解而表現樹皮腐爛癥狀,但有關梨腐爛病菌果膠酶基因的研究尚未見報道。本研究根據實驗室前期獲得的梨腐爛病菌強致病力菌株F-HN-6和弱致病力菌株F-HN-2a-1的轉錄組數據分析,預測獲得1個聚半乳糖醛酸酶相對表達量上調的基因Vamepg,通過基因敲除和轉化子致病力比較,對Vamepg基因在梨腐爛病菌侵染梨過程中的功能進行了初步研究,取得的主要研究結果如下:1、通過Real-Time PCR驗證Vamepg基因的相對表達量,結果表明梨腐爛病菌強致病力菌株F-HN-6 Vamepg基因的表達量為弱致病力菌株F-HN-2a-1的1.86倍,預測分析發(fā)現Vamepg基因編碼的外切聚半乳糖醛酸酶具有外分泌功能,能夠分泌到細胞膜外。2、采用Double-joint PCR方法構建線性敲除載體,利用PEG介導原生質體遺傳轉化方法,獲得能夠在含潮霉素的培養(yǎng)基上生長的轉化子。分別采用4對檢測引物篩選轉化子和Southern Blot鑒定為單拷貝,獲得4個缺失Vamepg基因的突變體。并利用基因互補方法獲得2個Vamepg基因的互補突變體,說明梨腐爛病菌可以采用線性載體利用PEG介導原型質體轉化方法進行基因敲除。3、缺失Vamepg基因的突變體在PDA培養(yǎng)基上生長速度略微降低,分生孢子器大小及形態(tài)無差異,但在枝條上的致病力顯著降低。Vamepg基因的互補突變體的生長速度和致病力與野生型菌株相比基本相同。體外酶活力測定發(fā)現,野生型菌株在培養(yǎng)過程中酶活力不斷增強,在10d時酶活力達到最大值;缺失Vamepg基因的突變體菌株體外酶活力一直維持在較低水平,在10d時酶活力未出現最大值。推測缺失Vamepg基因可能導致突變體分泌的外切聚半乳糖醛酸酶含量減少,從而減弱其對梨樹枝條的致病力。
[Abstract]:Pear rot disease is an important branch disease on pear trees in China. Pear orchards with serious incidence in northern pear producing areas often cause a large number of dead trees or destroy orchards. After the pathogen infects pear trees, it leads to cell wall degradation and shows bark decay symptoms. However, there is no report on the Pectinase gene of pear rot pathogen. Based on the analysis of transcriptional group data of strong pathogenic strain F-HN-6 and weakly pathogenic strain F-HN-2a-1 obtained in laboratory, a gene Vamepg, with up-regulated relative expression of polygalacturonase was predicted. The function of Vamepg gene in the process of pear infection was studied by comparing the pathogenicity of gene knockout and transformant. The main results were as follows: 1. The relative expression of Vamepg gene was verified by Real-Time PCR. The results showed that the expression of F-HN-6 Vamepg gene was 1.86 times higher than that of weak pathogenicity strain F-HN-2a-1. It was found that the exocrine polygalacturonase encoded by Vamepg gene had exocrine function. 2. The linear knockout vector was constructed by Double-joint PCR method, and the transformant which could grow on hygromycin medium was obtained by PEG mediated protoplast genetic transformation. Four pairs of primers were used to screen transformants and Southern Blot were identified as single copies, and four mutants without Vamepg gene were obtained. Two complementary mutants of Vamepg gene were obtained by gene complementary method, which indicated that pear rot pathogen could be knockout by PEG mediated protoplast transformation by linear vector. The growth rate of mutants deleted with Vamepg gene decreased slightly on PDA medium, but there was no difference in the size and morphology of conidia. However, the pathogenicity of Vamepg gene complementary mutants was significantly lower than that of wild type strains, and the growth rate and pathogenicity of Vamepg gene complementary mutants were basically the same as those of wild type strains. It was found that the enzyme activity of wild strains increased continuously during the culture process, and reached the maximum at 10 days. The enzyme activity of the mutant strain without Vamepg gene remained at a low level in vitro, and there was no maximum enzyme activity at 10 days. It is speculated that the deletion of Vamepg gene may lead to the decrease of extraneous polygalacturonase content secreted by the mutant, thus weakening the pathogenicity of the mutant to pear branches.
【學位授予單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S436.612.16

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