【摘要】：適宜的環(huán)境可以促進(jìn)蔬菜作物的正常生長(zhǎng)和發(fā)育,逆境脅迫會(huì)大幅度制約作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。此外,隨著中國(guó)工業(yè)化、城市化進(jìn)程的不斷加快,一系列廢氣、廢水、廢物被排放到空氣、水體、土壤中,累積了大量的重金屬。動(dòng)植物作為人類的主要食物來(lái)源,易被重金屬污染,且重金屬會(huì)在其體內(nèi)不斷積累,人類食用后會(huì)對(duì)自身健康造成嚴(yán)重危害。芹菜(ApiumgraveolensL.)屬于傘形科、芹屬的植物,是一種世界范圍廣泛種植的傘形科蔬菜作物,也是我國(guó)廣泛種植的重要葉菜類蔬菜之一。在逆境脅迫、重金屬污染下,芹菜植株的生長(zhǎng)和發(fā)育會(huì)受到制約和影響。本試驗(yàn)以芹菜為研究對(duì)象,分別從'六合黃心芹'、美國(guó)西芹'文圖拉'2個(gè)芹菜品種中獲得了Agmt2基因,該基因編碼的這類蛋白被認(rèn)為可以提高植物的抗逆境能力(尤其是抗重金屬脅迫能力)。對(duì)Agmt2基因序列進(jìn)行分析,并分析芹菜在不同逆境處理的表達(dá)圖譜,初步驗(yàn)證該基因功能。通過(guò)大腸桿菌表達(dá),分離純化出AgMT2蛋白,將Agmt2基因轉(zhuǎn)入到擬南芥中,獲得轉(zhuǎn)基因植株,以進(jìn)一步研究芹菜對(duì)重金屬脅迫的響應(yīng)機(jī)制。本論文的主要研究結(jié)果如下:1、基于本課題組芹菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),分別以南京地方品種'六合黃心芹'、美國(guó)西芹'文圖拉,為材料,克隆得到2個(gè)Agmt2基因。分析表明,芹菜Agmt2基因含有兩段內(nèi)含子,開(kāi)放閱讀框序列全長(zhǎng)為231 bp,編碼具有76個(gè)氨基酸殘基的AgMT2蛋白。'六合黃心芹'與'文圖拉'的Agmt2基因開(kāi)放閱讀框序列核苷酸相似度為99.56%,氨基酸序列100%一致。多重序列和理化性質(zhì)分析表明,AgMT2的分子量和等電點(diǎn)分別是7.5 kDa和4.95。多重序列分析發(fā)現(xiàn),金屬硫蛋白2的結(jié)構(gòu)域在高等植物的進(jìn)化中是高度保守的。進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示,AgMT2與同是傘形科的水芹和短果茴芹金屬硫蛋白2的進(jìn)化關(guān)系最近。熒光定量表達(dá)分析表明,Agmt2基因在芹菜中的表達(dá)具有組織特異性。在8種金屬(Co~(2+)、Ni~(2+)、Fe~(2+)、Mg~(2+)、Mn~(2+)、Ca~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+))和逆境脅迫(高低溫、干旱和鹽處理)處理下,Agmt2基因在'文圖拉,中的表達(dá)比'六合黃心芹'中的表達(dá)表現(xiàn)出更顯著的上升響應(yīng)。2、以從芹菜'文圖拉'中克隆得到的Agmt2基因?yàn)榛A(chǔ),構(gòu)建pET-30a(+)-AgMT2表達(dá)載體。構(gòu)建成功之后,通過(guò)大腸桿菌表達(dá),獲得濃度為0.42 mg/mL的AgMT2純化蛋白。SDS-PAGE判斷蛋白大小約為20.1 kDa。此外,將含有AgMT2表達(dá)的大腸桿菌細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞同時(shí)涂布在含有重金屬離子的培養(yǎng)基上進(jìn)行處理,鑒定AgMT2的金屬耐受性。結(jié)果表明,在受到Cd~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)脅迫后,表達(dá)AgMT2的大腸桿菌細(xì)胞比對(duì)照細(xì)胞的耐受性更強(qiáng),且攜帶Cd~(2+)、Zn~(2+)的能力比Cu~(2+)強(qiáng)。這表明,AgMT2是一種可以有效表達(dá)在大腸桿菌中,且具有特異性結(jié)合重金屬離子能力的功能蛋白。3、本試驗(yàn)使用蘸花法,將芹菜'文圖拉'中的Agmt2基因轉(zhuǎn)入到擬南芥中,結(jié)合不同的方法,如培養(yǎng)基篩選、GUS染色、PCR驗(yàn)證、表型觀察等多種方法鑒定獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。經(jīng)過(guò)種植和篩選,獲得轉(zhuǎn)基因T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。此外,為了進(jìn)一步驗(yàn)證AgMT2的重金屬解毒和自由基清除功能,將轉(zhuǎn)基因擬南芥植株和對(duì)照植株進(jìn)行15天重金屬處理,分別澆灌100μM的Cd~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)和蒸餾水,測(cè)定生理指標(biāo):谷胱甘肽(GSH)含量、葉綠素含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性和過(guò)氧化物酶(POD)活性。結(jié)果表明:在重金屬脅迫下,轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的GSH含量、總?cè)~綠素含量、SOD活性和POD活性變化量均明顯高于對(duì)照植株。這說(shuō)明,受到重金屬脅迫后,轉(zhuǎn)Agmt2基因擬南芥植株比對(duì)照植株表現(xiàn)出更強(qiáng)的重金屬解毒和自由基清除能力。本研究為傘形科重要蔬菜芹菜的逆境響應(yīng)的研究提供了資源,為進(jìn)一步深入開(kāi)展芹菜新品種選育奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S636.3

【參考文獻(xiàn)】

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