【摘要】：白蠟蟲(Ericerus pela Chavannes)二齡雄蟲分泌的白蠟,是重要的工業(yè)原料,廣泛地應用于化工、食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)。蠟酯合酶(wax synthase,WS)在白蠟生物合成途徑中催化長鏈脂肪醇和脂酰輔酶A生成酯,是蠟酯生物合成的關鍵酶。本研究根據(jù)實驗室前期獲得的ws全長序列,擴增其cDNA全長,用試劑盒體外轉錄了ws基因的dsRNA,注射于白蠟蟲雌成蟲體內,并用熒光定量PCR檢測ws基因的干涉效果,為驗證ws的生理功能奠定了基礎;同時利用Bac-to-Bac表達系統(tǒng)構建了ws基因的pFastBac~(TM)HT B表達載體,轉化大腸桿菌DH10Bac~(TM),經(jīng)抗性和藍白斑篩選獲得重組桿粒rBacmid/EpelWS,轉染Sf9(Spodoptera frugiperda)細胞,在Sf9細胞中初步進行表達,免疫熒光觀測并用蛋白免疫印跡驗證WS的表達。主要研究結果如下:(1)成功用試劑盒體外轉錄了ws基因的dsRNA,檢測結果表明,dsRNA已成功合成。(2)熒光定量PCR結果表明,注射ws基因的dsRNA一周后的試驗組白蠟蟲與經(jīng)gfp基因的dsRNA處理的對照組相比,試驗組體內ws mRNA轉錄量明顯下調,為后續(xù)功能的研究奠定了基礎。(3)利用Bac-to-Bac表達系統(tǒng)成功構建了WS表達載體,PCR鑒定及測序結果表明,目的片段已插入載體中。獲得了重組桿粒rBacmid/EpelWS,轉染Sf9細胞后收獲了P3病毒,蛋白免疫印跡表明:被P3病毒感染后的Sf9細胞總蛋白中,存在目的蛋白產生的雜交反應,WS被成功表達。本研究體外轉錄了白蠟蟲ws基因的dsRNA,并在昆蟲細胞中成功表達了WS,為白蠟蟲ws的生理功能及WS的生化特性的進一步研究奠定了重要基礎。
[Abstract]:White wax secreted by the second instar male worm of white wax worm (Ericerus pela Chavannes) is an important industrial raw material. It is widely used in chemical industry, food, medicine, cosmetics and other industries. Wax ester synthase (wax synthase,WS) catalyzes long chain fatty alcohol and fatty acyl coenzyme A to form esters in the biosynthetic pathway of white wax, which is the key enzyme in the biosynthesis of wax esters. In this study, according to the full-length ws sequence obtained earlier in the laboratory, the full-length cDNA was amplified. The dsRNA, of ws gene was transcribed in vitro and injected into the female adult of Wax Alba, and the interference effect of ws gene was detected by fluorescence quantitative PCR (FQ-PCR). It laid a foundation for verifying the physiological function of ws. At the same time, the pFastBac~ (TM) HT B expression vector of ws gene was constructed by Bac-to-Bac expression system and transformed into E. coli DH10Bac~ (TM),. The recombinant plasmid rBacmid/EpelWS, was transfected into Sf9 (Spodoptera frugiperda) cells by resistance and blue-white spot screening. The expression of WS was detected by immunofluorescence and Western blot. The expression of WS was detected by immunoblotting in Sf9 cells. The main results are as follows: (1) the dsRNA, detection results of ws gene were successfully transcribed with a kit in vitro. (2) the results of fluorescence quantitative PCR showed that dsRNA had been successfully synthesized. One week after injection of dsRNA with ws gene, the amount of ws mRNA transcript in the experimental group was significantly down-regulated compared with that in the control group treated with dsRNA of gfp gene. The results of PCR identification and sequencing showed that the target fragment had been inserted into the vector. (3) the WS expression vector was successfully constructed by Bac-to-Bac expression system, and the result of PCR identification and sequencing showed that the target fragment had been inserted into the vector. P3 virus was harvested after transfection of recombinant baculovirus rBacmid/EpelWS, into Sf9 cells. Western blot showed that there was hybridization reaction of target protein in the total protein of Sf9 cells infected with P3 virus and WS was expressed successfully. In this study, we transcribed the dsRNA, of white wax worm ws gene in vitro and successfully expressed WS, in insect cells, which laid an important foundation for the further study of the physiological function of ws and the biochemical characteristics of WS.
【學位授予單位】：中國林業(yè)科學研究院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S899.1

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本文編號：2463183