【摘要】：嗜鹽菌由于其獨特的耐鹽堿代謝機制和遺傳特性已受到許多微生物學(xué)、生態(tài)學(xué)和土壤學(xué)研究工作者的廣泛關(guān)注,是一類極具基礎(chǔ)研究價值和發(fā)掘新的耐鹽堿機制的重要微生物資源,而對這類微生物新的耐鹽機制的研究還可以為改造農(nóng)作物、開發(fā)微生物肥料、促進糧食增產(chǎn)等提供重要的理論依據(jù)。肇東鹽單胞菌(Halomonas zhaodongensis)是一株分離自黑龍江省肇東鹽堿地的革蘭氏陰性輕度嗜鹽菌,它能在0-15%的S-G培養(yǎng)基上生長(最適鹽濃度為3%)。本研究借助大腸桿菌(Escherichia coli)鹽敏感突變株KNabc(Δnha A,Δnha B,Δcha A),利用基因文庫篩選和功能互補相結(jié)合的技術(shù)方法,以發(fā)掘更多未知的耐鹽堿基因,并對它們所編碼的蛋白功能進行研究。本研究利用含有0.2 M Na Cl的氨芐抗性固體培養(yǎng)基作為篩選工具,用以克隆肇東鹽單胞菌中潛在的與耐鹽堿有關(guān)的基因。實驗共獲得21個能使KNabc突變株在0.2 M Na Cl的培養(yǎng)基上恢復(fù)生長能力的重組質(zhì)粒,經(jīng)過酶切及測序分析,發(fā)現(xiàn)這21個重組質(zhì)粒中,包括一對屬于DUF1538(domain of unknown function with No.1538 family)家族的蛋白和一個屬于DUF2062家族(domain of unknown function with No.2062 family)的蛋白,它們的功能尚未被注釋,實驗結(jié)果表明它們均是與耐鹽有關(guān)的基因,本文將它們分別被命名為ump AB(unknown membrane protein)、duf2062。ump AB基因序列全長1580 bp,由兩個開放閱讀框(ORF)組成,其中第一個閱讀框(ump A,765 bp)終止密碼子的最后一個堿基與第二個閱讀框(ump B,816 bp)起始密碼子的“A”堿基重疊在一起。它們編碼的蛋白序列分別由254個和271個氨基酸殘基組成,并將其分別命名為Hz_Ump A、Hz_Ump B(from Halomonas zhaodongensis)。跨膜預(yù)測分析也顯示,它們皆具有7個跨膜區(qū),它們和親緣關(guān)系最近的12個同系物有47個高度保守的氨基酸殘基,其中包括36個疏水性氨基酸、6個帶正電的氨基酸、5個極性氨基酸。同源比對顯示,Hz_Ump A和Hz_Ump B同屬于一個未知功能的DUF1538(domain of unknown function with No.1538family)蛋白家族,該家族在NCBI的Pfam數(shù)據(jù)庫中被定義為一類功能未知的、具有同一個保守結(jié)構(gòu)域的蛋白集合,其發(fā)現(xiàn)順序為1538。更重要的是,Hz_Ump A和Hz_Ump B與已知的鈉/氫逆向轉(zhuǎn)運蛋白或具有鈉/氫逆向轉(zhuǎn)運活性的其他蛋白沒有任何同源性。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示,它們與各自同源性在50%以上的同系物聚簇成闕值(bootstrap values)為96%和99%的兩個分支,但是與已知的鈉/氫逆向轉(zhuǎn)運蛋白或具有鈉/氫逆向轉(zhuǎn)運活性的其他蛋白的進化距離較遠。除此之外,功能互補的實驗揭示了ump AB基因具有一定的耐鹽堿能力,在0.4 M Na Cl或30 mM Li Cl的鹽脅迫下,ump AB能使鹽敏感突變株KNabc恢復(fù)生長,而單獨的ump A,ump B卻不能;當(dāng)Na Cl濃度為0-0.15 M時,與負對照相比,單獨的Hz_Ump B具有一定的耐鹽能力,而單獨的Hz_Ump A在有鹽條件下生長受到抑制;單獨的Hz_Ump A和Hz_Ump B具有一定程度的耐堿能力,且后者要好于前者。考慮到Hz_Ump B比Hz_Ump A多出一個親水的C末端,我們推測多出的這一親水C末端在其耐鹽堿過程中起到比較關(guān)鍵的作用。功能分析表明,Hz_Ump AB具有Na~+(Li~+,K~+)/H~+逆向轉(zhuǎn)運蛋白活性,且這個活性具有一定的p H依賴性,其最適活性p H為9.0,對Na~+、Li~+、K~+三種離子的K0.5值分別是0.26±0.06 m M、0.46±0.09 m M、0.41±0.06 m M,換而言之,Hz_Ump AB對底物的偏好性是:Na~+K~+Li~+。為了進一步研究Hz_Ump AB的細胞定位及二聚體鑒定,我們構(gòu)建了共表達載體p ETDuet-1-ump AB,運用超離蛋白分級法對菌體的膜蛋白及胞漿蛋白進行分離,Western Blot檢測顯示,Hz_Ump A和Hz_Ump B的蛋白條帶(約25 KDa)僅在全蛋白樣品和膜蛋白樣品中被檢測出來,而且它們的確是大小不同的兩個蛋白,這就表明,Hz_Ump AB均定位于細胞質(zhì)膜。Co-IP顯示,在免疫沉淀Hz_Ump A蛋白時,用Western Blot分析也能檢測到Hz_Ump B的蛋白條帶,表明Hz_Ump AB很可能是由兩個膜蛋白構(gòu)成的一個異源二聚體。duf2062基因序列全長552 bp,可編碼的蛋白由183個氨基酸殘基組成,將其命名為Hz_DUF2062。功能互補實驗顯示,它可使鹽敏感突變株KNabc在0.3 M Na Cl或5 m M LiCl的培養(yǎng)基上恢復(fù)生長,而且在偏堿性的環(huán)境中,其生長能力要明顯好于負對照。這表明了該基因具有一定的耐鹽堿能力,且可能具有鈉/氫逆向轉(zhuǎn)運蛋白活性。跨膜預(yù)測分析顯示,Hz_DUF2062具有3個跨膜區(qū),和它們親緣關(guān)系最近的同系物有54個高度保守的氨基酸殘基,其中主要包括28個疏水性氨基酸、10個帶正電的氨基酸和13個極性氨基酸;同源比對表明,Hz_DUF2062屬于一個未知功能的DUF2062蛋白家族,而與已知的鈉/氫逆向轉(zhuǎn)運蛋白或具有鈉/氫逆向轉(zhuǎn)運活性的蛋白沒有任何同源性。系統(tǒng)進化發(fā)育學(xué)分析表明,Hz_DUF2062與同家族的其他蛋白聚集在一簇,闕值(bootstrap values)為91%,且此分支與已知的鈉/氫逆向轉(zhuǎn)運蛋白或具有鈉/氫逆向轉(zhuǎn)運活性的蛋白的進化距離較遠。功能分析表明,Hz_DUF2062具有Na~+(Li~+、K~+)/H~+逆向轉(zhuǎn)運蛋白活性,以上活性具有pH依賴性,其最適活性p H為8.5,對Na~+、Li~+、K~+三種離子的K0.5值分別是0.2±0.13 mM、0.22±0.1 m M、0.43±0.08 m M,換而言之,Hz_DUF2062對底物的偏好性是:Na~+Li~+K~+。綜上所述,本研究首先對Hz_Ump AB和Hz_DUF2062兩個蛋白的功能進行了注釋,首次報道了未知功能的DUF1538家族和DUF2062家族成員的確切功能,即代表DUF1538家族的蛋白對Hz_Ump AB和代表DUF2062家族的蛋白Hz_DUF2062具有Na~+(Li~+,K~+)/H~+逆向轉(zhuǎn)運蛋白活性,同時還重點研究了Hz_Ump AB的細胞定位及這個異源二聚體的鑒定�；谝陨辖Y(jié)果,我們建議來自肇東鹽單胞菌(H.zhaodongensis)中的Hz_Ump AB蛋白對和Hz_DUF2062蛋白是兩個新型的Na~+(Li~+、K~+)/H~+逆向轉(zhuǎn)運蛋白。而且,我們也通過Co-IP首次揭示了鈉/氫逆向轉(zhuǎn)運蛋白的新結(jié)構(gòu),即鈉/氫逆向轉(zhuǎn)運蛋白的結(jié)構(gòu)除了同源二聚體和異源多聚體之外,還應(yīng)有像Hz_Ump AB這樣的異源二聚體結(jié)構(gòu)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q933;S156.4

【參考文獻】

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