【摘要】：青錢柳中含有多種活性次生代謝產(chǎn)物,已被批準為一種新的食品原料,但由于其繁育困難導致資源匱乏,嚴重制約了其開發(fā)利用。三萜是其中重要的活性成分之一,本實驗室利用植物細胞培養(yǎng)技術建立了穩(wěn)定的青錢柳細胞懸浮培養(yǎng)體系,以之生產(chǎn)三萜酸,采用添加外源誘導子方法以促進三萜的合成,已從信號分子轉導途徑和MAPK途徑初步探索了ANE(黑曲霉誘導子)的誘導作用機制。為了更加深入地探索ANE促進細胞合成三萜的作用機制,本文研究了ANE誘導作用下青錢柳懸浮培養(yǎng)細胞抗氧化相關酶的變化規(guī)律,采用Illumina HiSeq 4000測序技術對細胞進行了轉錄組測序分析,以發(fā)掘青錢柳轉錄水平的生物信息,對ANE誘導下抗氧化系統(tǒng)、調(diào)控次生代謝途徑的調(diào)控因子、JA信號轉導途徑及三萜代謝途徑中的差異表達基因進行了全面的分析,并對關鍵酶基因CpSS(青錢柳鯊烯合成酶)進行了克隆及生物信息學分析,從基因表達調(diào)控的角度探討了ANE誘導調(diào)控青錢柳萜類代謝的分子機制。主要結果和結論如下:(1)ANE誘導作用下青錢柳懸浮培養(yǎng)細胞抗氧化相關酶的活性變化規(guī)律:加入ANE誘導10 h左右,細胞三萜含量開始升高,至60 h時達到最高值,含量由12.47μg/mg增至36.46μg/mg,為對照組的3.36倍。ANE誘導作用下,過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和磷脂酶(PLC)這五種抗氧化系統(tǒng)相關酶的活性均發(fā)生了明顯的時序性變化,各酶的活性均較對照組有明顯的提高。SOD的活性分別在誘導1 h、8 h、66 h時出現(xiàn)了3個峰值,POD酶的活性在分別在誘導1 h、8 h、21 h、66 h時出現(xiàn)4個峰值,CAT酶的活性分別在誘導2 h、8 h、24 h、54 h和66 h時出現(xiàn)了5個峰值,PAL酶的活性分別在誘導7 h、18 h和42 h時出現(xiàn)了3個峰值,PLC酶的活性分別在誘導6 h和24 h時出現(xiàn)了峰值。(2)ANE作用下細胞轉錄組測序與分析:本文采用Illumina HiSeq 4000測序平臺分別對青錢柳懸浮細胞對照組(未添加ANE)、ANE誘導20 h和60 h這三個樣本進行了轉錄組測序,獲得了67230個高質(zhì)量Unigene序列,平均長度和N50分別為744 bp和1379 bp;將組裝得到的67230個Unigenes通過BlastX與NR、Pfam、String、Swissprot、GO、COG和KEGG七個公共數(shù)據(jù)庫進行序列比對分析,有49.78%的Unigenes比對到公共數(shù)據(jù)庫中;共有7694個Unigenes注釋到25個COG功能分類中;共有19398個Unigenes注釋到GO功能分類中,獲得了128396條GO注釋信息。此外,獲得了14986個SSR序列,為進一步的遺傳學分析提供了豐富的信息。(3)ANE作用下細胞差異表達基因分析:通過對細胞Unigenes的差異表達分析,發(fā)現(xiàn)誘導20 h、誘導60 h與CK對照組的DEGs(差異表達基因)分別有24788、24336個;其中與抗氧化系統(tǒng)相關的20個POD、3個SOD和1個CAT候選基因發(fā)生了上調(diào);與JA信號轉導途徑相關的9個JAZ、2個JAR和12個MYC2候選基因發(fā)生了差異表達;鑒定出了15990條候選TF(轉錄因子)基因,其中可能參與調(diào)控三萜代謝途徑的bHLH、ERF、NAC、C2H2和WRKY等TF家族的差異表達基因較多;鑒定出了75個參與萜類骨架生物合成途徑的候選基因及22個參與三萜類生物合成途徑的候選基因。此外,采用RT-qPCR檢測對與三萜代謝相關的12個表達量上調(diào)基因進行驗證,結果顯示這12個基因表達量上調(diào),與轉錄組測序數(shù)據(jù)一致。(4)CpSS全長基因克隆及序列分析:本文根據(jù)青錢柳懸浮培養(yǎng)細胞轉錄組測序信息,注釋到了鯊烯合成酶的候選基因;以該基因序列為基礎,采用RT-PCR和RACE技術從細胞中克隆出了全長為1667 bp的CpSS基因cDNA序列,該序列包含了一個1245 bp的完整ORF,編碼414個氨基酸;CpSS序列與胡桃SS基因的相似度最高,相似度達到了97%,與白樺、葡萄、大豆、甘草、可可等物種的相似度都達85%以上,與胡桃和白樺的親緣性關系最近。序列分析表明,CpSS蛋白屬于不穩(wěn)定親水蛋白,具有典型的鯊烯合成酶保守區(qū)和結構域,存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中,由多個α螺旋組成空穴狀結構,該結構與大多數(shù)植物鯊烯合成酶蛋白的空間結構相似。綜上所述,青錢柳懸浮培養(yǎng)細胞在ANE誘導作用下,抗氧化相關酶的活性明顯提高,通過JA信號轉導途徑介導,調(diào)控三萜合成途徑中的轉錄因子,使其途徑中的關鍵酶基因發(fā)生差異表達,從而促進細胞中三萜的合成與積累。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：江西農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q943.2;TS201

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 陳月華;朱艷;張翔;秦民堅;;植物細胞懸浮培養(yǎng)中次生代謝產(chǎn)物積累的研究進展[J];中國野生植物資源;2016年03期

2 熊瓊瓊;尹忠平;陳繼光;上官新晨;蔣艷;彭大勇;;黑曲霉誘導子促進青錢柳懸浮細胞合成三萜[J];食品科技;2016年03期

3 郭春梅;尹忠平;上官新晨;陳繼光;付曉;;硝普鈉對青錢柳懸浮細胞三萜合成的影響[J];現(xiàn)代食品科技;2014年04期

4 王凌健;方欣;楊長青;李建戌;陳曉亞;;植物萜類次生代謝及其調(diào)控[J];中國科學:生命科學;2013年12期

5 李田;上官新晨;尹忠平;陳繼光;蔣艷;;青錢柳葉三萜化合物分離與鑒定[J];江西農(nóng)業(yè)大學學報;2013年05期

6 谷榮輝;洪利亞;龍春林;;植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物的途徑[J];植物生理學報;2013年09期

7 張月紅;上官新晨;尹忠平;陳繼光;;青錢柳葉片、愈傷組織及懸浮細胞中齊墩果酸和熊果酸測定[J];江西農(nóng)業(yè)大學學報;2012年02期

8 尹忠平;上官新晨;米麗雪;蔣艷;吳少福;張月紅;;青錢柳細胞懸浮培養(yǎng)及三萜化合物積累[J];深圳大學學報(理工版);2011年05期

9 上官新晨;蔣艷;米麗雪;陳繼光;張清峰;鄒利;;5種大量元素對青錢柳愈傷組織生長及黃酮類化合物積累的影響[J];江西農(nóng)業(yè)大學學報;2011年03期

10 翟俏麗;范桂枝;詹亞光;;真菌誘導子促進白樺懸浮細胞三萜的積累[J];林業(yè)科學;2011年06期

相關博士學位論文 前1條

1 劉冉;誘導子調(diào)控紅松細胞合成松多酚機制的研究[D];東北林業(yè)大學;2015年

相關碩士學位論文 前3條

1 王煥;MeJA影響陽春砂揮發(fā)性萜類和轉錄組變化的研究[D];廣州中醫(yī)藥大學;2015年

2 高睿;香鱗毛蕨鯊烯合成酶基因的克隆與表達[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2014年

3 薛璐莎;前體和真菌誘導子對雷公藤懸浮細胞次生代謝產(chǎn)物合成的影響[D];西北農(nóng)林科技大學;2013年

，

本文編號：2452017