【摘要】：擬松材線蟲(Bursaphelenchus mucronatus)是一種松樹內(nèi)寄生線蟲,廣泛分布于歐亞大陸的天然松林中。它與松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)在形態(tài)學(xué)與生物學(xué)特性等方面都十分相似,是松材線蟲的近緣種,它們擁有相同的食物資源與媒介昆蟲,占據(jù)相同生態(tài)位。從擬松材線蟲發(fā)現(xiàn)至今已有30余年,尚無研究表明其與松樹大量死亡有關(guān)。近年來,越來越多的研究表明擬松材線蟲部分蟲株也具有較強的致病性。迄今為止,關(guān)于擬松材線蟲的研究報道主要集中在其與松材線蟲的區(qū)別、鑒定上,在其基因和蛋白水平上的研究鮮有報道。本研究通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)分析不同致病力擬松材線蟲蟲株在致病條件下差異表達(dá)基因的種類、數(shù)量和功能,并鑒定出了一些與致病相關(guān)的差異表達(dá)蛋白。為進一步研究擬松材線蟲致病機制及致病相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控奠定基礎(chǔ)。初步研究成果如下:1.擬松材線蟲致病性研究為探討擬松材線蟲的致病性,將6株不同地理來源的擬松材線蟲蟲株接種到2年生的馬尾松和濕地松上,接種后的松苗置于野外環(huán)境下觀察,供水充足,溫度自然。結(jié)果表明,這6株擬松材線蟲蟲株對兩種松苗的致病力不同:馬尾松苗的死亡率在22.2-83.3%之間,而濕地松苗的死亡率在0-33.3%之間。為進一步探討擬松材線蟲的致病性,在松苗致病力測定的基礎(chǔ)上,挑選3株致病力顯著差異的擬松材線蟲接種到12年生黑松上,接種后的松樹自然撫育。黑松死亡率在22.2-66.7%之間。實驗期間,實驗地的月均降雨量和月均氣溫與當(dāng)?shù)貧v史月降雨量、月氣溫相近,無極端天氣情況出現(xiàn)。本實驗證明了擬松材線蟲具有致病性,高溫、干旱等環(huán)境脅迫非其致病的必要條件。2.擬松材線蟲群體遺傳結(jié)構(gòu)分析為探討不同地理來源的擬松材線蟲蟲株的遺傳背景,通過ISSR分子標(biāo)記對來自國內(nèi)14個省份及日本、韓國的61株擬松材線蟲進行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。非加權(quán)組平均法聚類分析將擬松材線蟲分為2個分枝,進一步通過主成分分析更清楚地將擬松材線蟲分為4個以上組分。Mantel檢測表明,擬松材線蟲各蟲株間的地理距離和遺傳距離呈顯著的弱相關(guān)性(p0.05,r=0.312)。擬松材線蟲各蟲株間的遺傳分化系數(shù)為0.341,遠(yuǎn)大于遺傳分化閾值0.25;另外,擬松材線蟲各蟲株間的基因流為1.091,接近生殖隔離指數(shù)1。這些說明,可能是長期的地理隔離,導(dǎo)致擬松材線蟲各蟲株間的生殖隔離,進而形成不同致病力的擬松材線蟲蟲株。3.擬松材線蟲不同生境和不同發(fā)育階段內(nèi)參基因的篩選本研究應(yīng)用geNorm、NormFinder、BestKeeper、deltaCq、RefFinder等5種分析方法評價了8個常見的內(nèi)參基因在擬松材線蟲不同發(fā)育階段和生境條件下的表達(dá)穩(wěn)定性。結(jié)果表明:在不同生境中,微管蛋白,18S核糖體RNA和泛素結(jié)合酶的表達(dá)較為穩(wěn)定;而在不同發(fā)育階段,微管蛋白,組蛋白和18S核糖體RNA表達(dá)較為穩(wěn)定。4.擬松材線蟲轉(zhuǎn)錄組與蛋白組分析應(yīng)用RNA測序和蛋白質(zhì)同位素標(biāo)記相對和絕對定量技術(shù)采集了兩個致力差異顯著的擬松材線蟲蟲株的轉(zhuǎn)錄組和蛋白組數(shù)據(jù),共獲得了約40000個基因和5000個蛋白。擬松材線蟲的轉(zhuǎn)錄組和蛋白組兩個組學(xué)水平上的數(shù)據(jù)相關(guān)性較弱(r=0.138),表明轉(zhuǎn)錄后調(diào)控發(fā)生在致病過程中。功能分析發(fā)現(xiàn)5個致病相關(guān)蛋白在強致病力蟲株中都是高表達(dá)的,其中過氧化物酶、脂肪酸與視黃醇結(jié)合蛋白、谷胱甘肽過氧化物酶與應(yīng)對寄主防御反應(yīng)有關(guān),纖維素酶、擴張蛋白與破壞寄主細(xì)胞壁有關(guān)。因此,擬松材線蟲的致病機制可能與適應(yīng)寄主體內(nèi)生活有關(guān)。5.擬松材線蟲脂肪酸與視黃醇結(jié)合蛋白和鈣網(wǎng)蛋白基因的克隆與功能驗證基于擬松材線蟲轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù),我們應(yīng)用cDNA末端快速克隆技術(shù)克隆了擬松材線蟲脂肪酸與視黃醇結(jié)合蛋白和鈣網(wǎng)蛋白基因的cDNA全長,分別是694和1630 bp。其中脂肪酸與視黃醇結(jié)合蛋白基因完整開放閱讀框長度為537 bp,編碼178個氨基酸,而鈣網(wǎng)蛋白基因完整開放閱讀框長度為1209 bp,編碼402個氨基酸。為確認(rèn)脂肪酸與視黃醇結(jié)合蛋白和鈣網(wǎng)蛋白基因與擬松材線蟲致病的相關(guān)性,構(gòu)建了這兩個基因的RNA干擾體系。應(yīng)用RT-qPCR檢測經(jīng)dsRNA和M9處理過的靶基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)量,其中以M9處理后的靶基因表達(dá)量為100%,GFP dsRNA處理后靶基因的表達(dá)量沒有顯著變化,而靶基因dsRNA處理后靶基因的表達(dá)量顯著下降,其中FAR基因mRNA的表達(dá)水平只有對照的26.9%,CRT基因mRNA的表達(dá)水平也僅有對照的17.4%。不同處理的擬松材線蟲幼蟲在灰葡萄孢上培養(yǎng)10 d后,采用貝爾曼漏斗法收集線蟲。M9處理后的幼蟲平均每20對產(chǎn)生1239個F1代,而FAR dsRNA、CRT dsRNA和外源對照基因GFP dsRNA處理后的幼蟲平均每20對產(chǎn)生945、906和1133個F1代。同時將RNAi處理后的線蟲接種到2年生的黑松上,評估RNAi對擬松材線蟲致病力的影響。接種五周后,M9、GFP dsRNA、FAR dsRNA三個處理出現(xiàn)死亡松苗,CRT dsRNA處理組第六周出現(xiàn)死亡松苗。靶基因dsRNA處理組死亡率(33.3-41.7%)顯著低于M9(83.3%)和外源基因(75%)對照組,說明脂肪酸與視黃醇結(jié)合蛋白在擬松材線蟲致病過程中起著重要作用。
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【學(xué)位授予單位】：南京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S763.18
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本文編號：2449545