發(fā)布時間：2019-03-27 19:41

【摘要】：黃酮類化合物是一類廣泛存在于植物中的次生代謝產物,對于植物的自身防御和生理調節(jié)具有重要的作用。黃酮類化合物還具有抗氧化、抑菌消炎、抑制腫瘤細胞活性、抗HIV活性等功能,且毒性較小,藥用價值較高。種子植物中黃酮代謝途徑已研究的較為透徹,作為黃酮含量較高的蕨類植物,其黃酮代謝途徑尚不清楚。查爾酮異構酶(CHI)是黃酮代謝途徑的關鍵限速酶之一,其主要功能為催化柚皮素查爾酮轉化為柚皮素,生成的柚皮素是后續(xù)多條代謝通路的前體物質,種子植物中的CHI基因屬于查爾酮異構酶基因家族,分為TypeΙ、TypeⅡ、TypeⅢ、TypeⅣ四個類型,具有不同的生物學功能。然而,蕨類植物中CHI基因的結構特征、類型及其功能尚不清楚,研究蕨類植物中CHI基因,對闡明黃酮代謝途徑的分子機制,揭示CHI基因的功能及其演化均具有重要的科學意義。本研究以紅蓋鱗毛蕨為實驗材料,應用轉錄組測序、PCR及高效液相色譜技術對查爾酮異構酶基因(CHI)進行克隆及表達分析,并對該基因序列的結構及蛋白結構和蛋白功能等方面做了生物信息學分析。本研究的實驗結果主要有以下幾個方面:1.利用Ilumina Hiseq 2000平臺對紅蓋鱗毛蕨拳卷葉進行測序,獲得8.5G數(shù)據量。對獲得的數(shù)據進行組裝拼接,共獲得Unigene 143604條。依據注釋結果分析獲得CHI可能性基因6條,經分析選取其中3條作為CHI的候選基因。2.利用轉錄組測序技術,成功克隆到三條基因的ORF序列,將三條基因序列重新命名為:DeCHI1、DeCHI2和DeCHI3。生物信息學分析表明,DeCHI1的ORF全長651bp,編碼216個氨基酸;DeCHI2的ORF全長822bp,編碼273個氨基酸;DeCHI3的ORF全長738bp,編碼245個氨基酸。聚類分析表明,DeCHI1與TypeΙ和TypeⅡ呈并列關系;DeCHI2屬于Type IV型;DeCHI3屬于Type III型。3.本研究成功構建3條CHI的重組質粒pET32a-DeCHI1、pET32a-DeCHI2、pET32a-DeCHI3,將重組質粒導入到BL21感受態(tài)細胞中構建原核表達載體,并用IPTG誘導獲得融合蛋白,經SDS-PAGE鑒定獲得蛋白大小分別為39.7kDa、45.0kDa、43.1kDa,與預期的蛋白大小相一致。4.本研究以柚皮素查爾酮和異甘草素為底物,分別采用3條基因純化后的融合蛋白對底物進行催化,催化產物上高效液相色譜(HPLC)檢測,檢測結果表明:(1)DeCHI1、DeCHI2和DeCHI3的蛋白酶均能催化柚皮素查爾酮轉化為柚皮素,同時也能催化異甘草素轉化為甘草素,與目前報道的種子植物Type III CHI和Type IV CHI蛋白酶沒有催化活性不同;(2)DeCHI1不僅能催化柚皮素查爾酮,還能催化異甘草素轉化為甘草素,與現(xiàn)有報道僅豆科植物TypeⅡ可催化異甘草素的結論不同,進化樹聚類分析結果顯示DeCHI1與種子植物的TypeⅠ和TypeⅡ在同一簇中,推測其具有TypeⅠ和TypeⅡ的功能,推測結果與實驗結果相符;(3)在DeCHI1、DeCHI2和DeCHI3的蛋白酶催化柚皮素查爾酮轉化為柚皮素的過程中推測可能有中間產物產生,產物的具體成分有待進一步研究。綜上所述,紅蓋鱗毛蕨具有不同類型的CHI基因,但其功能尚未產生明顯的分化,它們產生的酶均能夠催化柚皮素查爾酮轉化為柚皮素,同時也能催化異甘草素轉化為甘草素,這反映了蕨類植物黃酮類次生代謝途徑較為原始的特點。
[Abstract]:Flavonoids are a kind of secondary metabolites which are widely present in the plants, which play an important role in the self-defense and physiological regulation of the plants. The flavonoid compound has the functions of resisting oxidation, inhibiting bacteria and diminishing inflammation, inhibiting tumor cell activity, resisting HIV activity and the like, and has small toxicity and high medicinal value. The metabolic pathway of the flavonoids in the seed plants has been studied thoroughly. As the high-content ferns, the metabolic pathway of the flavone is not clear. The chalcone isomerase (CHI) is one of the key speed-limiting enzymes of the flavone metabolic pathway, It is divided into four types: Type 鈪，

本文編號：2448499