【摘要】：溫度依賴型性別決定(TSD)是環(huán)境性別決定(ESD)模式中的重要表現(xiàn)形式之一,其個體性別取決于胚胎發(fā)育過程中的環(huán)境溫度,但其具體分子調(diào)控機理仍然不明確。之前對爬行動物TSD的研究,多集中在不同物種性別決定模式的描述、激素在TSD中的作用以及調(diào)控TSD基因的挖掘等方面;表觀遺傳學最新研究表明,非編碼RNA和DNA甲基化修飾可能是爬行動物TSD模式的重要調(diào)控機制。cyp19a1基因編碼產(chǎn)生的芳香化酶是將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素的關(guān)鍵酶,是調(diào)控爬行動物TSD模式的重要基因,也是性別相關(guān)miRNAs的一個重要潛在靶基因。因此,本研究以烏龜為研究對象,在三個溫度下(26℃、29℃和32℃)孵化龜卵,對烏龜?shù)腡SD模式進行驗證,同時鑒定不同孵化溫度下性腺差異表達的miRNAs,并且還以cyp19a1基因為候選基因,研究其甲基化修飾對烏龜性別決定的影響。本研究獲得如下重要結(jié)果:1.孵化溫度對烏龜性別決定的影響在26℃、29℃和32℃三個溫度下孵化烏龜卵并進行性別鑒定,結(jié)果顯示:26℃、29℃和32℃孵化條件下的雌性性別比率分別為3.3%、36.6%和100%,證明了烏龜屬于典型的溫度依賴型性別決定動物(TSD),同時屬于TSD Ia類,即高溫是雌性產(chǎn)生溫度,低溫是雄性產(chǎn)生溫度,這也為后續(xù)烏龜TSD相關(guān)的表觀遺傳機制研究提供了基礎(chǔ)。2.不同孵化溫度下烏龜性腺中差異表達miRNAs的鑒定在烏龜孵化的溫度敏感期,采集了AKG復合體樣品,通過下代測序技術(shù),分析鑒定了溫度敏感期內(nèi)(TSP)不同孵化溫度下烏龜性腺差異表達的miRNAs。首次確定了1013個已知miRNAs和730個新miRNAs,其中有18個miRNAs在不同孵化溫度下存在表達差異。通過qPCR實驗證實了7個miRNAs的表達式模式與測序結(jié)果一致。對預測得到的miRNAs的靶基因進行KEGG富集分析,結(jié)果表明內(nèi)吞作用和軸突引導通路可能是參與烏龜TSD過程中的重要通路。這些結(jié)果表明miRNAs可能參與了烏龜?shù)男詣e決定過程。3.不同孵化溫度下烏龜cyp19a1基因啟動子區(qū)甲基化研究通過TA克隆和DNA測序等技術(shù),成功克隆了烏龜cyp19a1基因5'側(cè)翼區(qū)序列,并通過生物信息學分析預測了該區(qū)域轉(zhuǎn)錄起始位點及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點,初步確定了烏龜cyp19a1基因核心啟動子區(qū)域,并利用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測其熒光活性,結(jié)果證實了該區(qū)域具有啟動子活性。通過亞硫酸氫鹽測序等技術(shù),檢測了AKG復合體中cyp19a1基因啟動子區(qū)在不同孵化溫度下的甲基化修飾模式。結(jié)果表明,烏龜cyp19a1基因啟動子區(qū)3個CpG位點的整體甲基化水平在不同孵化溫度間存在顯著差異,雌性孵化溫度下(32℃)的甲基化發(fā)生率極顯著低于雄性孵化溫度(26℃)(P0.01),并且顯著低于中間溫度(29℃)(P0.05)。實時定量PCR及ELIAS結(jié)果表明,在雌性孵化溫度下(32℃),cyp19a1基因的表達量及雌激素水平顯著高于雄性孵化溫度(26℃)及中間溫度(P0.01)。以上試驗結(jié)果表明雌性孵化溫度(FPT)能夠通過降低cyp19a1基因啟動子區(qū)的甲基化水平,來提高cyp19a1基因的表達水平以及雌激素水平,從而進一步?jīng)Q定烏龜?shù)男詣e。這證明了cyp19a1基因啟動子區(qū)的甲基化修飾對孵化溫度的響應(yīng),可能是烏龜TSD的重要調(diào)控機制。
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【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4

【參考文獻】

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