【摘要】：黃瓜在世界范圍內(nèi)廣泛種植,其產(chǎn)量與品質(zhì)深受重視。致病菌尖孢鐮刀菌黃瓜轉(zhuǎn)化型(Fusarisum oxysporum f.sp. cucumerinum)引起的黃瓜枯萎病很難防控,嚴(yán)重限制了黃瓜的產(chǎn)量與質(zhì)量,因此對其抗病機制的研究顯得尤為重要。前期實驗在研究枯萎病菌脅迫下的黃瓜抗、感品系根系差異蛋白質(zhì)組時,一個與黃瓜枯萎病抗性顯著相關(guān)的蛋白被鑒定出來(CsaUNM029170.1),該蛋白注釋為LRR型蛋白家族成員,暫命名為CsLRR-pf1,其CDS區(qū)長1317bp (GenBank登錄號：gi|449450244)。本試驗克隆與分析了CsLRR-pfl基因的啟動子序列,利用技術(shù)分析了CsLRR-pfl的基因表達特性,同時構(gòu)建了黃瓜CsLRR-pfl的原核表達載體和GFP表達載體,以期為深入研究該LRR型抗病相關(guān)蛋白在黃瓜防御反應(yīng)中的作用及機制奠定基礎(chǔ)。克隆了CsLRR-pfl基因的編碼區(qū)與啟動子序列,并應(yīng)用PlantCARE在線軟件對CsLRR-pfl啟動子區(qū)域序列分析。結(jié)果表明,在CsLRR-pfl基因起始密碼子ATG上游的啟動子正反義鏈中預(yù)測到以下調(diào)控元件：1個高水平表達相關(guān)元件5UTR Py-rich stretch;1個增強木質(zhì)部中及花瓣中表達而阻抑韌皮部表達相關(guān)元件AC-Ⅱ；4個厭氧誘導(dǎo)的順式作用元件ARE；1個ATBP-1結(jié)合相關(guān)AT-rich元件；1個TGAGTCA motif相關(guān)順式作用元件ATGCAAAT motif;1個生長素響應(yīng)相關(guān)順式作用元件AuxRR-core;1個真菌激發(fā)子相關(guān)順式作用元件Box-W1;光響應(yīng)元件G-box 2個、GA-motif2個、GATA-motif1個、GT1-motif 1個、MNF11個、Spl2個；2個熱脅迫相應(yīng)相關(guān)順式作用元件HSE；2個光響應(yīng)相關(guān)MYB結(jié)合位點MRE；37個CAAT-box；88個TATA-box；4個防御與脅迫響應(yīng)元件TC-rich repeats;1個損傷與病原菌響應(yīng)元件W box;1個胚乳表達所需元件Skn-1-motif;1個生物節(jié)律控制相關(guān)元件circadian;1個赤霉素響應(yīng)元件P-box; MeJA響應(yīng)相關(guān)順式作用元件CGTCA-motif與TGACG-motif各2個。這些調(diào)控元件在啟動子序列上基本呈均勻分布。通過定量分析了CsLRR-pfl基因在GA3、MeJA、 SA、ETH、 ABA等脅迫下的表達模式。根據(jù)預(yù)測結(jié)果,選擇了5種外源激素處理以及枯萎病菌侵染黃瓜幼苗,分析了CsLRR-pf1基因的表達情況。枯萎病菌接種后F9(高抗枯萎病)、995(高感枯萎病)的CsLRR-pf1基因的表達量都被誘導(dǎo)表達,表達高峰分別為第11天、13天,CsLRR-pf1基因在F9中的大量積累早于995,推論這可能是導(dǎo)致其抗感性狀差異的主要原因。同時也說明CsLRR-pf1可能參與黃瓜對枯萎病菌的響應(yīng)；GA3、 MeA與SA處理后,F9中CsLRR-pfl基因均被誘導(dǎo)表達且變化趨勢相同,可能是因為就是SA、 GA3、 MeJA的信號通路交叉而在誘導(dǎo)植物防御響應(yīng)過程中互相協(xié)同。然而,ABA與ETH處理后,F9與995中CsLRR-pfl基因響應(yīng)不同處理的表達模式有相似也有差異,這說明了生物響應(yīng)外界不同環(huán)境時的機制極為復(fù)雜。構(gòu)建了黃瓜CsLRR-pfl原核表達載體,菌落PCR鑒定后用Nde I/Hind Ⅲ雙酶切鑒定確定其原核表達載體構(gòu)建成功。同時,構(gòu)建了此基因與GFP融合表達載體,通過菌落PCR與Xba Ⅰ/ BamH Ⅰ雙酶切鑒定確定融合表達載體構(gòu)建成功,為后續(xù)深入研究該LRR型抗病相關(guān)蛋白在脅迫響應(yīng)中的作用等奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:The cucumber is widely cultivated in the world, and its yield and quality are of great importance. Fusarium oxysporum f. sp. The cucumber fusarium wilt is difficult to control, and the yield and quality of the cucumber are severely restricted, so the research on the disease resistance mechanism of the cucumber is particularly important. In the early-stage experiment, when the root system of cucumber was resistant to Fusarium oxysporum under the stress of Fusarium oxysporum, a protein related to the resistance of cucumber fusarium wilt was identified (CsA UNM029170.1), and the protein was expressed as a member of the LRR-type protein family, and it was designated as CsLRR-pf1, and its CDS was 1317bp (GenBank accession number: Gi | 449450244). The promoter sequence of CsLRR-pfl was cloned and analyzed, and the expression of CsLRR-pfl was analyzed by using the technique. The prokaryotic expression vector and the GFP expression vector of CsLRR-pfl were constructed. In order to study the role and mechanism of the LRR-type disease-related protein in the defense of cucumber. The coding region and the promoter sequence of the CsLRR-pfl gene were cloned and the region sequence analysis of the CsLRR-pfl promoter was carried out using the PlantCARE on-line software. The results showed that the following regulatory elements were predicted in the antisense strand of the promoter upstream of the initiation codon ATG of the CsLRR-pfl gene:1 high-level expression-related element 5UTR Py-rich strecch;1 enhancement xylem and expression in the petal to inhibit the expression of the phloem-related elements AC-II; 4 anaerobic-induced cis-acting elements ARE;1 ATBP-1 binding related AT-rich element;1 TGAGTCA motif-related cis-acting element ATGCAAAT motif;1 auxin response-related cis-acting element AuxRR-core;1 fungal elicitor-related cis-acting element Box-W1; light response element G-box 2, GA-motif2, GATA-motif1, GT1-motif 1, MNF11, Spl2;2 thermal stress-related cis-acting element HSE;2 photoresponse-related MYB binding site MRE;37 CAAT-box;88 TATA-box;4 defense and stress response elements TC-rich repeats;1 injury and pathogen response element W box;1 endosperm expression required element Skn-1-motif; One biorhythm control related element, circle,1 gibberellin response element, P-box, and MeJA response-related cis-acting element CGTCA-motiv and two TGACG-motif. These regulatory elements are substantially uniformly distributed over the promoter sequence. The expression pattern of CsLRR-pfl gene under the stress of GA3, MeJA, SA, ETH and ABA was quantitatively analyzed. The expression of CsLRR-pf1 gene was analyzed based on the results of the prediction and the selection of five exogenous hormones and the infection of cucumber seedlings by Fusarium oxysporum. The expression of CsLRR-pf1 gene of F9 (high resistance to fusarium wilt) and 995 (high-sense fusarium wilt) was induced by Fusarium oxysporum. The expression of CsLRR-pf1 gene in 995 (high-sense fusarium wilt) was induced and the expression of CsLRR-pf1 gene in F9 was earlier than 995. At the same time, CsLRR-pf1 may be involved in the response of cucumber to Fusarium oxysporum. After treatment with GA3, MeA and SA, the CsLRR-pfl gene in F9 is induced to be expressed and the variation trend is the same, probably because the signal paths of SA, GA3 and MeJA cross with each other in the course of inducing plant defense response. However, after the ABA and ETH treatment, the expression patterns of the CsLRR-pfl genes in F9 and 995 were similar to those of the different treatments. The prokaryotic expression vector of the cucumber CsLRR-pfl was constructed and the expression vector of the prokaryotic expression vector was determined by Nde I/ HindIII double-enzyme digestion. At the same time, this gene and the GFP fusion expression vector were constructed, and the construction of the fusion expression vector was determined by the colony PCR and XbaI/ BamH I double-enzyme digestion and identification, and the basis for further study of the role of the LRR-type disease-related protein in the stress response was established.
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S436.421

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 ;如何減少黃瓜的苦味?[J];中國改革(農(nóng)村版);2002年01期

2 李秀啟;黃瓜根系兩次生理性死亡及防治措施[J];長江蔬菜;2004年01期

3 李桂軍;黃瓜“樹”上結(jié)黃瓜——訪中國農(nóng)科院黃瓜“樹"課題組負(fù)責(zé)人楊其長博士[J];當(dāng)代蔬菜;2004年06期

4 崔家俊;;土壤深耕與黃瓜生長狀況的關(guān)系[J];河南農(nóng)業(yè);2005年12期

5 李品漢;;科學(xué)種植讓黃瓜不再“苦”[J];云南農(nóng)業(yè);2006年02期

6 李建良;張冰;;黃瓜苦味原因及防止對策[J];蔬菜;2006年04期

7 季淑文;;黃瓜施肥新技術(shù)[J];農(nóng)民致富之友;2009年05期

8 何歡宇;蔡潤;;創(chuàng)博微生物肥料在設(shè)施連作黃瓜上的應(yīng)用試驗[J];上海蔬菜;2010年03期

9 侯廣福;黃瓜貯藏新技術(shù)[J];農(nóng)村新技術(shù);1995年08期

10 唐明貴;黃瓜套種涼薯效益高[J];湖南農(nóng)業(yè);1996年02期

相關(guān)會議論文 前10條

1 許勇;王永健;;黃瓜耐低溫研究中幾個問題的討論[A];中國科學(xué)技術(shù)協(xié)會第二屆青年學(xué)術(shù)年會園藝學(xué)論文集[C];1995年

2 郭世榮;汪天;馬月花;;根的呼吸活性與黃瓜和番茄根際低氧耐性的關(guān)系[A];中國園藝學(xué)會第五屆青年學(xué)術(shù)討論會論文集[C];2002年

3 吳佳文;宮海軍;;硅對番茄和黃瓜鎘的吸收、分配及抗氧化防御系統(tǒng)的影響[A];中國園藝學(xué)會2013年學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2013年

4 王永健;張峰;許勇;陳青君;張海英;;黃瓜低溫弱光耐受性機理及其應(yīng)用研究的主要進展[A];中國園藝學(xué)會第十屆會員代表大會暨學(xué)術(shù)討論會論文集[C];2005年

5 杜永臣;;高溫對黃瓜根系可溶性糖含量和α-半乳糖苷酶活性的影響[A];中國科協(xié)第3屆青年學(xué)術(shù)年會園藝學(xué)衛(wèi)星會議暨中國園藝學(xué)會第2屆青年學(xué)術(shù)討論會論文集[C];1998年

6 郭世榮;橘昌司;高洪波;汪天;;營養(yǎng)液溫度和溶解氧濃度對黃瓜植株氮化物含量的影響[A];中國園藝學(xué)會第六屆青年學(xué)術(shù)討論會論文集[C];2004年

7 蔣紅云;張燕寧;馮平章;;石蒜等植物對黃瓜生長抑制作用的初步研究[A];中國第二屆植物化感作用學(xué)術(shù)研討會暨中國植物保護學(xué)會植物化感作用專業(yè)委員會成立大會論文摘要集[C];2005年

8 徐慧妮;王秀峰;孫旭東;楊鳳娟;杜棟良;;黃瓜MAPK基因的生物信息學(xué)分析及原核表達[A];中國園藝學(xué)會十屆二次理事會暨學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2007年

9 許良政;劉志偉;劉惠娜;廖富林;;不同光照條件對缺鐵黃瓜根系Fe~(3+)還原酶活性的影響[A];梅州市自然科學(xué)優(yōu)秀學(xué)術(shù)論文集（第十屆）[C];2010年

10 杜靜;郭世榮;宋夏夏;孫錦;;亞精胺對Ca(NO_3)_2脅迫下黃瓜幼苗根系生長和形態(tài)結(jié)構(gòu)變化的影響[A];2013中國園藝學(xué)會設(shè)施園藝分會學(xué)術(shù)年會·蔬菜優(yōu)質(zhì)安全生產(chǎn)技術(shù)研討會暨現(xiàn)場觀摩會論文摘要集[C];2013年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 趙福順;黃瓜高產(chǎn)的關(guān)鍵措施[N];吉林農(nóng)村報;2013年

2 定州市塔宣村 任士哲;五項措施做保障越夏黃瓜不“鬧秧”[N];河北科技報;2013年

3 趙學(xué)寧;黃瓜生長大小不均的原因及防治[N];山西科技報;2013年

4 于文英;黃瓜:看瓜須 知長勢[N];陜西科技報;2013年

5 任丘市農(nóng)業(yè)局 劉亞娟;秋延遲黃瓜遇不良天氣的管理[N];河北科技報;2014年

6 寧夏吳忠氣象局 黃萬銀;黃瓜生長對環(huán)境條件的要求[N];陜西科技報;2001年

7 衡水 韓會霞;黃瓜味苦 巧管能除[N];河北農(nóng)民報;2009年

8 劉桂蘭;預(yù)防苦黃瓜有絕招[N];山西科技報;2001年

9 胡良惠;黃瓜巧種植 一架收兩茬[N];山西科技報;2003年

10 王明華;黃瓜苦味的形成原因及預(yù)防措施[N];山西科技報;2004年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 王燕;黃瓜動蛋白參與果實發(fā)育早期細(xì)胞分裂和細(xì)胞膨大過程的研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

2 周新剛;連作黃瓜土壤生態(tài)環(huán)境特征及對黃瓜生長的影響[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

3 繆e，

本文編號：2435659