【摘要】：研究背景胰腺癌癥狀非特異,早期具有高侵襲轉(zhuǎn)移特性,是一種低切除率的實體腫瘤。因此,臨床醫(yī)生面臨的主要問題是許多不能切除的胰腺癌患者。到目前為止,由于其惡性程度高,對化療及放療不敏感,胰腺癌仍然缺乏有效的治療措施。一般來說,基于吉西他濱的化療進展期胰腺癌患者中位生存期大約在6-8月。然而,從研究角度看,胰腺癌細胞維持生存機制研究的進展說明化學治療仍是最有潛力的治療。近年來研究發(fā)現(xiàn)Hedgehog(Hh)信號途徑異常活化是胰腺癌進展過程中主要事件。研究表明,Hh信號通路在胰腺癌中的激活是通過SHh基因上調(diào)及核轉(zhuǎn)錄因子Gli1調(diào)節(jié)下游靶基因最終實現(xiàn)的。對高轉(zhuǎn)移性胰腺癌細胞株中通過c DNA微陣列技術(shù)對Gli1靶基因進行系統(tǒng)性研究,通過對靶基因仔細分析,發(fā)現(xiàn)Hh信號通路下游復雜分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)細胞生存,并提示BIRC3能顯著抑制凋亡或許是一關(guān)鍵節(jié)點。研究并闡明胰腺癌細胞中Gli1-依賴性BIRC3通路維持細胞生存的這一關(guān)鍵節(jié)點的具體機制,對尋找胰腺癌可能的潛在治療靶點具有重要意義。研究目的:1.研究胰腺癌細胞中Hh信號通路關(guān)鍵元件過表達及抑制情況下BIRC3的變化,探討Hh信號通路調(diào)節(jié)BIRC3基因轉(zhuǎn)錄效果。2.研究Hh信號通路轉(zhuǎn)錄因子Gli1與BIRC3啟動子可能結(jié)合位點,明確Gli1調(diào)節(jié)BIRC3基因轉(zhuǎn)錄具體機制。3.研究Gli1-依賴性BIRC3通路不同情況下胰腺癌細胞增殖和凋亡情況,探討Gli1-依賴的BIRC3與胰腺癌細胞生存之間的關(guān)系。研究方法:1.構(gòu)建SHh過表達/Gli1-shRNA干擾慢病毒載體,轉(zhuǎn)染胰腺癌細胞AsPC-1、BxPC3,Panc-1,熒光定量PCR檢測Hh通路中SHh過表達和Gli1干擾時各胰腺癌細胞中SHh、Gli1以及BIRC3mRNA的表達。2.從真核生物啟動子數(shù)據(jù)庫尋找并下載人源BIRC3啟動子序列,生物信息學方法分析Gli1增強子與BIRC3啟動子區(qū)可能結(jié)合位點,SHh過表達/Gli1-shRNA干擾慢病毒載體轉(zhuǎn)染胰腺癌細胞As PC-1,染色質(zhì)免疫共沉淀(XChIP-PCR)和雙熒光素酶基因報告分析Gli1與BIRC3基因結(jié)合具體位點。3.胰腺癌細胞AsPC-1,分別經(jīng)SHh過表達/Gli1-shRNA干擾/si BIRC3后,熒光定量PCR檢測SHh、Gli1、BIRC3及PNCAmRNA變化,western blot檢測SHh、Gli1、BIRC3及PNCA蛋白變化;MTT法檢測轉(zhuǎn)染前后細胞增殖能力變化,Annexin V-FITC/PI雙染法流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡,并進行各組細胞caspase-3活性檢測。研究結(jié)果1.三種胰腺癌細胞中,SHh過表達時,SHh、Gli1、BIRC3mRNA水平同步升高,Gli1干擾時SHhmRNA無明顯升高,隨Gli1mRNA表達下降,BIRC3mRNA水平同步下降,說明BIRC3mRNA水平與SHh-Gli1信號途徑活化呈正相關(guān)。2.生物信息學分析顯示BIRC3啟動子區(qū)有3個位點與標準Gli1增強子序列“GACCACCCA”配對率達89%,染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果顯示Gli1抗體能富集BIRC3啟動子,提示Gli1與BIRC3啟動子在細胞內(nèi)存在特異性結(jié)合;SHh過表達時熒光素酶活性隨Gli1基因表達增加而升高,Gli1干擾時各位點熒光素酶活力無顯著變化,而SHh過表達位點2和3則熒光素酶活力存在明顯升高提示位點2和位點3是Gli1與BIRC3啟動子區(qū)的可能結(jié)合位點。3.5組胰腺癌As PC-1細胞經(jīng)熒光定量PCR及western blotting檢測顯示,隨SHh/Gli1mRNA及蛋白表達增加,BIRC3、PCNA的mRAN及蛋白水平顯著增加,敲除BIRC3這種趨勢顯著逆轉(zhuǎn);MTT細胞增殖實驗顯示,SHh過表達后細胞增殖增強,Gli1干擾后細胞增殖減弱;si BIRC3后顯著逆轉(zhuǎn)SHh過表達誘導的細胞增殖反應(yīng);流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡顯示,Gli1干擾后細胞凋亡率顯著增加,SHh過表達細胞凋亡率變化不明顯,siBIRC3后細胞凋亡率顯著增加;caspase-3活性檢測結(jié)果顯示,Gli1干擾后caspase-3活性明顯增加;SHh過表達后caspase-3活性降低,siBIRC3后caspase-3活性則明顯升高。研究結(jié)論1.Gli1通過順式作用元件促進BIRC3轉(zhuǎn)錄。2.SHh-Gli1信號途徑促進胰腺癌細胞生存部分通過這種Gli1依賴性BIRC3模式實現(xiàn)的。
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【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.9

【參考文獻】

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本文編號：2423137