【摘要】：哺乳動(dòng)物精子受精前需要在雌性生殖道內(nèi)停留一段時(shí)間,期間精子的形態(tài)和生理會(huì)發(fā)生必要的變化,這樣精子就會(huì)具備受精所需的能力,這個(gè)過程稱之為獲能。精子及時(shí)獲能和產(chǎn)生頂體反應(yīng)在自然受精過程中很重要,同樣維持精子在受精前未獲能狀態(tài)也非常關(guān)鍵。時(shí)至今日,我們對(duì)哺乳動(dòng)物精子獲能的機(jī)制雖然研究甚多但是未知依舊很多。PLCζ在生殖發(fā)育中意義重大,其對(duì)精子的發(fā)生發(fā)育及卵母細(xì)胞激活等相關(guān)研究日益成為生殖發(fā)育的研究熱點(diǎn)。PLCζ家族中的睪丸發(fā)育特異性蛋白-27 基因(testis development specific protein gene 27,NYD-SP27),被認(rèn)為是一種新的精子內(nèi)源性去能因子,目前已證實(shí)NYD-SP27在人類和小鼠精子獲能上具有重要作用,但NYD-SP27在綿羊精子獲能中的作用未見相關(guān)報(bào)道。本研究基于克隆綿羊NYD-SP27基因,探究該蛋白的表達(dá)特性,篩選高效的干擾片段,為揭示NYD-SP27在綿羊精子發(fā)生及獲能中的作用機(jī)制提供一定的科學(xué)依據(jù)。[目的]本研究通過構(gòu)建綿羊NYD-SP27基因的哺乳動(dòng)物真核表達(dá)載體,構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)NYD-SP27蛋白的BHK-21細(xì)胞系,構(gòu)建和篩選慢病毒干擾載體,為之后研究NYD-SP27表達(dá)上調(diào)、下調(diào)對(duì)綿羊精子發(fā)生及獲能的影響提供相應(yīng)的分子工具。[方法]從綿羊睪丸組織提取RNA,反轉(zhuǎn)錄后克隆綿羊NYD-SP27基因,擴(kuò)增出P2A-Flag-NYDSP片段,并將其插入到真核表達(dá)載體pDsRed1-C1中,利用豬捷申病毒2A肽(P2A)將該蛋白和紅色熒光蛋白連接以實(shí)現(xiàn)共表達(dá),將重組質(zhì)粒pDsRed-P2A-Flag-NYDSP轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24小時(shí)后熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果,然后用G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株,利用基因組DNA進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增、RT-PCR 擴(kuò)增、間接免疫熒光(Indirect immunofluorescence assay,IFA)和Western blot對(duì)NYD-SP27基因的表達(dá)進(jìn)行鑒定。將培養(yǎng)20代后的穩(wěn)定細(xì)胞系BHK-SP27-21與正常BHK-21細(xì)胞比較形態(tài)和生長速度。針對(duì)綿羊NYD-SP27基因的序列,設(shè)計(jì)干擾NYD-SP27的短發(fā)卡RNA和陰性對(duì)照干擾RNA,并克隆至病毒干擾載體上,構(gòu)建干擾綿羊NYD-SP27基因的慢病毒干擾載體PLL3.7-NYDSP-shRNA。將慢病毒干擾載體與包裝質(zhì)粒(VSVG、pMDL和REV)共轉(zhuǎn)染HEK-293FT細(xì)胞,進(jìn)行慢病毒包裝,之后測(cè)定滴度,用慢病毒感染靶細(xì)胞BHK-SP27-21,利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)目的基因的擴(kuò)增,分析干擾效率,進(jìn)而篩選出干擾效率高的干擾片段。[結(jié)果]擴(kuò)增出綿羊NYD-SP27基因,經(jīng)過測(cè)序比對(duì),大小為1617bp,成功將P2A和Flag標(biāo)簽引入目的基因片段,成功構(gòu)建了綿羊NYD-SP27的真核表達(dá)載體。基因組PCR和RT-PCR均能擴(kuò)增出1617bp的特異性條帶,結(jié)果表明,NYD-SP27基因穩(wěn)定整合至宿主細(xì)胞基因組,IFA的結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組陽性細(xì)胞上可觀察到綠色熒光,而陰性對(duì)照沒有熒光。Western blot結(jié)果說明NYD-SP27蛋白能夠在BHK-21細(xì)胞中正常表達(dá),分子大小約為63 kDa,和預(yù)期結(jié)果一致,這樣的大小也表明在NYD-SP27蛋白和紅色熒光蛋白翻譯過程中,P2A成功自我剪切,同時(shí)表明本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的穩(wěn)定細(xì)胞系正確。共設(shè)計(jì)4條干擾NYD-SP27的短發(fā)卡RNA和1條陰性對(duì)照RNA,并成功構(gòu)建了相對(duì)應(yīng)的干擾慢病毒載體,繼而分別與輔助質(zhì)粒一起包裝出干擾慢病毒NYD-SP27 NYDSP-shRNA-LV,使用熒光實(shí)時(shí)定量PCR成功篩選出干擾效率較高的干擾片段NYDSP-shRNA-3。[結(jié)論]成功克隆出了綿羊NYD-SP27基因,構(gòu)建了重組真核表達(dá)質(zhì)粒pDsRed-P2A-Flag-NYDSP,為后續(xù)試驗(yàn)提供了材料。成功建立了穩(wěn)定表達(dá)綿羊NYD-SP27基因的BHK-21細(xì)胞系,將其命名為BHK-SP27-21細(xì)胞。成功篩選出干擾效率較高的干擾載體NYDSP-shRNA-1,并能顯著降低綿羊NYD-SP27基因mRNA的表達(dá)量。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q78;S826

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本文編號(hào)：2404644