【摘要】：背景和目的:人類棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白樣4和人類間變性淋巴瘤激酶融合基因EML4-ALK是新發(fā)現(xiàn)的非小細(xì)胞肺癌的驅(qū)動(dòng)基因,具有獨(dú)特的臨床病理生理特征。ALK基因下游信號(hào)通路的異常持續(xù)激活是其重要的下游信號(hào)通路,而導(dǎo)致其下游基因持續(xù)激活的原因不明。細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子(suppressor of cytokine signaling,SOCS)是一類在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起重要作用的負(fù)調(diào)控因子,主要通過(guò)抑制JAK蛋白酪氨酸激酶(janus protein tyrosine kinase,JAK激酶)信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)即JAK-STAT等信號(hào)通路來(lái)調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。腫瘤中常存在SOCS基因的甲基化異常導(dǎo)致的失活,從而導(dǎo)致JAK2-STAT等信號(hào)通路持續(xù)異�；罨�。本研究的目的在于探討SOCS1和SOCS3對(duì)EML4-ALK融合基因陽(yáng)性肺癌細(xì)胞的影響及其SOCS1和SOCS3啟動(dòng)子區(qū)的甲基化情況。方法:甲基化特異性PCR檢測(cè)EML4-ALK陽(yáng)性H2228肺癌細(xì)胞及肺癌組織中SOCS1和SOCS3啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài),并通過(guò)測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5’-Aza-d C處理H2228細(xì)胞,并通過(guò)real-time PCR和Western blot檢測(cè)SOCS1和SOCS3的表達(dá)水平變化。ALK抑制劑TAE684、ALK-Si RNA處理H2228細(xì)胞,抑制ALK表達(dá),Western blot檢測(cè)p-JAK2、p-STAT3、p-STAT6、SOCS1和SOCS3的表達(dá)水平變化。在EML4-ALK陰性表達(dá)的HEK293細(xì)胞中過(guò)表達(dá)ALK后,Western blot檢測(cè)JAK-STAT信號(hào)通路的活化情況及SOCS1和SOCS3的表達(dá)水平變化。用p EGFp-SOCS1和p EGFp-SOCS3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H2228細(xì)胞,通過(guò)RT-PCR和Western blot檢測(cè)SOCS1和SOCS3的表達(dá)水平變化,檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染效果,并用EDU、CCK8和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞周期的變化情況。結(jié)果:對(duì)7例EML4-ALK陽(yáng)性肺癌患者腫瘤組織和EML4-ALK陽(yáng)性細(xì)胞H2228進(jìn)行甲基化特異性PCR反應(yīng),結(jié)果表明H2228細(xì)胞和所有的7例EML4-ALK陽(yáng)性肺癌組織中都存在SOCS1啟動(dòng)子區(qū)的部分甲基化,H2228細(xì)胞和7例組織中的3例存在SOCS3基因啟動(dòng)子區(qū)的部分甲基化。Real-time RCR和Western-Blot結(jié)果也證明DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5'-Aza-d C去甲基化處理H2228細(xì)胞后SOCS1和SOCS3表達(dá)上調(diào)。HEK-293細(xì)胞過(guò)表達(dá)ALK 48h后,JAK-STAT信號(hào)通路被激活,ALK和p-ALK蛋白水平的表達(dá)明顯增高,伴隨著ALK和p-ALK的表達(dá)增強(qiáng)p-JAK2、p-STAT3、p-STAT6的表達(dá)也隨之增加。分別用ALK-Si-RNA和ALK抑制劑TAE-684處理H2228細(xì)胞后,ALK和p-ALK蛋白水平的表達(dá)明顯降低,并且p-JAK2、p-STAT3、p-STAT6的表達(dá)也都降低,JAK-STAT信號(hào)通路受到抑制。對(duì)H2228細(xì)胞進(jìn)行p EGFp-SOCS1、p EGFp-SOCS3轉(zhuǎn)染處理后,H2228細(xì)胞中SOCS1和SOCS3的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平上較對(duì)照組相比分別增高了10.3倍和93.4倍。Western-Blot結(jié)果示轉(zhuǎn)染SOCS1的H2228細(xì)胞中SOCS1的表達(dá)明顯增高,而轉(zhuǎn)染SOCS3的H2228細(xì)胞SOCS3表達(dá)也明顯增高,亦表明轉(zhuǎn)染是成功的。隨著SOCS1和SOCS3的表達(dá)明顯增加,我們發(fā)現(xiàn)兩組細(xì)胞中p-ALK、p-JAK2、p-STAT3、p-STAT6的表達(dá)均有所降低,說(shuō)明JAK-STAT信號(hào)通路受到抑制。EDU的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明H2228細(xì)胞在轉(zhuǎn)染SOCS1和SOCS3后,其細(xì)胞增殖能力都要明顯低于轉(zhuǎn)染空載體的H2228細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示對(duì)照組細(xì)胞活力56.25%,p EGFp-SOCS1組細(xì)胞活力36.45%(P0.05),p EGFp-SOCS3組細(xì)胞活力38.72%(P0.05)。CCK-8結(jié)果與EDU結(jié)果一致,H2228細(xì)胞過(guò)表達(dá)SOCS1和SOCS3后與對(duì)照組相比,細(xì)胞代謝活性抑制率分別為48.49%(P0.05)和58.33%(P0.05)。FCM進(jìn)行細(xì)胞周期分析,對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組G1期和S期細(xì)胞數(shù)量基本沒(méi)有差異,但是兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組G2期細(xì)胞的數(shù)量均明顯高于對(duì)照組,統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組P值均小于0.05。結(jié)論:EML4-ALK(+)的H2228細(xì)胞及部分肺癌組織中存在SOCS1和SOCS3啟動(dòng)子區(qū)的異常甲基化;HEK293細(xì)胞中過(guò)表達(dá)ALK后,JAK-STAT通路被激活,抑制H2228細(xì)胞中ALK表達(dá)后JAK-STAT通路被抑制,證明JAK-STAT通路可能是ALK的下游信號(hào)通路。H2228細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SOCS1和SOCS3后,JAK-STAT通路被抑制,細(xì)胞的代謝活力和增殖能力受到抑制,流式細(xì)胞周期分析示兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組G2期細(xì)胞的數(shù)量均明顯高于對(duì)照組。我們斷定SOCS1和SOCS3主要是通過(guò)抑制JAK-STAT信號(hào)通路來(lái)抑制細(xì)胞代謝和增殖的,其對(duì)細(xì)胞周期的影響主要是對(duì)G2期/M期的阻滯。H2228細(xì)胞中SOCS1和SOCS3啟動(dòng)子區(qū)的異常甲基化使得SOCS1和SOCS3的表達(dá)降低,其對(duì)JAK-STAT信號(hào)通路的抑制作用消失,最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2402465