【摘要】：茶樹多酚類物質(zhì)是茶湯風(fēng)味形成的主要成分,其中黃酮醇糖苷在茶的澀味中扮演著重要角色。茶樹中游離的黃酮醇很少,多與糖基結(jié)合,形成黃酮醇糖苷類形式存在。黃酮醇合成酶基因(FLS)是黃酮醇合成的直接關(guān)鍵酶,與黃酮醇糖苷的積累是緊密相關(guān)的。本文首先對茶樹中的黃酮醇糖苷進行了定性和定量分析,為進一步探索茶樹中黃酮醇糖苷含量變化機理,本文還對茶樹黃酮類物質(zhì)積累的關(guān)鍵基因黃酮醇合成酶(FLS)的功能進行了驗證。主要研究結(jié)果如下:1.茶樹中黃酮醇糖苷的定性和定量分析。利用HPLC-TOF-MS鑒定了茶樹鮮葉中15種黃酮醇糖苷;利用UPLC-QQQ-MS/MS的MRM模式建立了這些黃酮醇糖苷的定量方法;并通過六個黃酮醇糖苷的標(biāo)準(zhǔn)品對定量方法進行了評估,結(jié)果表明,在一定的濃度范圍內(nèi),回歸方程都具有很好的線性關(guān)系(R20.99);最低檢測限和最低定量限分別小于0.01和0.03ng;回收率在90%和105%之間;保留時間和峰面積變化的日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)差分別小于0.15%和3.9%;日間相對標(biāo)準(zhǔn)差分別小于0.26%和4%。表明該方法具有較高的靈敏度、良好的精密度和重現(xiàn)性。利用UPLC-QQQ-MS/MS的MRM模式建立的定量方法,研究了四個不同茶樹品種不同組織發(fā)育階段的黃酮醇糖苷的含量變化。相對定量結(jié)果發(fā)現(xiàn),黃酮醇單糖苷,雙糖苷和三糖苷主要積累在嫩葉中,少量積累在芽、成熟葉和幼莖中,其中槲皮素-3-O-蕓香糖苷在成熟葉和幼莖中含量也很高。絕對定量結(jié)果發(fā)現(xiàn),其中6種黃酮醇糖苷在不同組織發(fā)育階段的絕對含量變化與相對定量的結(jié)果一致,主要積累在嫩葉中。此外,我們還發(fā)現(xiàn)這六個黃酮醇糖苷在老莖和根中的含量極少。2茶樹黃酮醇合成酶功能的研究。本文克隆了3條茶樹黃酮醇合成酶(CsFLS)基因,利用RT-PCR技術(shù)定量分析了3條CsFLS基因在不同組織發(fā)育階段和不同誘導(dǎo)處理下的表達水平差異,結(jié)果表明,3條CsFLS基因在芽、一葉、二葉、成熟葉和3幼莖中都有表達;其中CsFLS1基因在芽中表達量最高,而CsFLS2和CsFLS3基因在二葉中表達量最高,它們在成熟葉和莖中表達量都較低;3條CsFLS基因的表達都受蔗糖和ABA誘導(dǎo)明顯上調(diào),而其他處理條件下,CsFLS基因表達量變化都不明顯。為進一步驗證它們的功能,實驗將3條CsFLS基因整合到pRSFDuet-1載體上,構(gòu)建成帶組氨酸(His)標(biāo)簽的重組融合表達載體,并導(dǎo)入BL21大腸桿菌表達,再利用Ni柱純化獲得重組融合蛋白。HPLC體外酶活檢測結(jié)果顯示,3條重組CsFLS融合蛋白均可分別以DHK、DHQ和DHM為底物催化K、Q和M的產(chǎn)生;CsFLS2融合蛋白對于DHK、DHQ和DHM的Km值分別為22.9μM,80μM和65.55μM。構(gòu)建了EHA105-pCB2004-CsFLS2載體,并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染煙草葉片,通過除草劑篩選獲得了轉(zhuǎn)基因植株。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)CsFLS2基因的煙草相比野生型,其花色明顯變淺,花青素含量明顯降低,而黃酮醇糖苷的含量增加。進一步在本氏煙幼苗葉片組織中瞬時表達帶有GFP的CsFLS2基因,發(fā)現(xiàn)CsFLS2定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核上。
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【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S571.1

【參考文獻】

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1 許文;傅志勤;林婧;黃學(xué)城;陳丹;于虹敏;黃澤豪;范世明;;HPLC-Q-TOF-MS和UPLC-QqQ-MS的三葉青主要成分定性與定量研究[J];中國中藥雜志;2014年22期

2 謝素霞;張媛;郭凱琳;王磊;袁紅雨;;一個新的茶樹黃酮醇合酶基因的克隆和表達分析[J];植物生理學(xué)通訊;2009年11期

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本文編號：2396068