【摘要】：類病斑突變體常表現(xiàn)出對一種或多種病原菌的抗性,對于植物抗性育種和抗病機制研究具有重要意義。葉片衰老是葉發(fā)育的最后階段,有研究表明,水稻籽粒灌漿所需營養(yǎng)物質(zhì)主要來自于葉片光合作用,高達60%~80%,延緩葉片衰老有助于水稻增產(chǎn)。經(jīng)甲基磺酸乙酯(EMS)誘變優(yōu)良秈型水稻恢復(fù)系縉恢10號,獲得一個穩(wěn)定遺傳的類病斑早衰突變體lmps1(lesion mimic and premature senescence 1)。本研究以縉恢10號為野生型(WT)對照,對lmps1突變體進行表型鑒定、光合色素與光合參數(shù)分析、細胞超微結(jié)構(gòu)分析、組織化學分析、抗氧化酶活性和H2O2含量測定、防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因表達分析等一系列研究,并利用分子標記對控制該突變體性狀的基因進行定位。主要結(jié)果如下:1.lmps1突變體表型特征lmps1突變體在苗期表現(xiàn)正常,到分蘗早期葉片開始出現(xiàn)褐色小斑點,斑點數(shù)目隨著植株生長持續(xù)增加;進入孕穗期后,倒4葉尖開始萎黃,出現(xiàn)早衰表型;成熟期,斑點幾乎布滿所有葉片,衰老加速,整個植株呈黃褐色直至死亡。與WT相比,lmps1突變體的穗粒數(shù)顯著降低,株高、穗長、有效穗數(shù)、結(jié)實率以及千粒重均極顯著下降。2.lmps1突變體的光響應(yīng)分蘗期對lmps1突變體尚未出現(xiàn)類病斑的葉片進行遮光處理,未遮光部位產(chǎn)生大量的斑點,而用錫箔紙遮光部位沒有斑點或僅產(chǎn)生少量斑點;恢復(fù)光照后,遮光部位逐漸出現(xiàn)類病斑。表明lmps1類病斑突變表型的產(chǎn)生受光信號誘導(dǎo)。3.光合色素含量測定光合色素含量降低是植物葉片衰老的一個重要生理特征。孕穗期的光合色素含量測定結(jié)果顯示,lmps1突變體的葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)、總?cè)~綠素(Total Chl)及類胡蘿卜素(Car)含量均極顯著低于WT。其各功能葉之間的光合色素含量較WT也存在差異,其中倒3、倒4葉的Chla、Chlb、Total Chl及Car含量均極顯著低于倒1葉和倒2葉;且除葉綠素b外,倒3葉Chla、Chlb、Car含量均顯著高于倒4葉,而WT則是相反,倒3、倒4葉更高。葉綠素含量的變化表明lmps1葉片已經(jīng)在生理水平上進入衰老階段,且衰老是從倒4葉向倒1葉發(fā)展。4.光合參數(shù)分析光合色素含量降低必將影響光合效率。與WT相比,lmps1的凈光合速率(Pn,μmol m-2 s-1)、氣孔導(dǎo)度(Gs,mmol m-2 s-1)、胞間CO2濃度(Ci,μmol mol-1)與蒸騰速率(Tr,mmol m-2 s-1)均差異極顯著。從各功能葉之間的光合參數(shù)來看,WT的Pn、Gs、Ci、Tr在倒1、倒2、倒3葉中依次顯著降低。lmps1的Pn呈下降趨勢,倒2、倒3葉之間無明顯差異;Gs、Ci、Tr在倒3葉最高,倒1、倒2葉之間無明顯差異。表明lmps1光合效率降低。5.細胞超微結(jié)構(gòu)比較透射電鏡觀察結(jié)果顯示lmps1的葉綠體數(shù)目減少,部分葉綠體類囊體片層結(jié)構(gòu)嚴重損傷降解,且葉尖處降解程度比葉片中部嚴重。但lmps1葉肉細胞中也存在結(jié)構(gòu)完好的葉綠體,表明受損葉綠體前期發(fā)育良好,在葉片早衰過程中逐漸降解消亡。lmps1葉綠體的降解模式,與其葉片的衰老表型基本一致,即葉尖開始,然后逐漸向突變體葉片中部與基部延伸。6.組織化學分析孕穗期對WT和lmps1突變體的葉片進行硝基藍四氮唑(NBT)和臺盼藍染色。NBT染色結(jié)果顯示,lmps1突變體的葉片斑點部位及其周圍被染成深藍色,而WT葉片僅有極少數(shù)深藍色小斑點。經(jīng)臺盼藍染色后,突變體lmps1的葉片斑點部位及其周圍被染成深藍色,WT葉片呈現(xiàn)出較為均勻的藍色。表明lmps1突變體的斑點部位伴隨著活性氧(ROS)積累,并且該處有大量細胞死亡或細胞膜遭到破壞。7.葉片H2O2含量檢測及抗氧化酶活性變化與WT相比:孕穗期的lmps1各葉片H2O2含量顯著升高;倒2葉和倒3葉的POD活性降低,CAT活性在倒1葉、倒2葉、倒3葉中顯著降低;SOD活性在倒1葉中與WT無明顯差異,倒2和倒3葉中顯著降低。WT和lmps1突變體各功能葉之間的SOD活性、CAT活性均隨葉齡增長而降低,差異顯著,而POD活性在各功能葉片中差異不顯著�？寡趸富钚院瓦^氧化氫含量變化表明在lmps1突變體植株體內(nèi),隨著突變表型的出現(xiàn),其葉片細胞遭受ROS脅迫,從而導(dǎo)致細胞死亡。8.lmps1遺傳模式分析用秈稻西農(nóng)1A與lmps1突變體構(gòu)建的F1群體表型均與野生型一致,F2代發(fā)生性狀分離。共收獲正常單株1214株、類病斑早衰突變單株420株,正常單株與突變表型單株數(shù)目的比值為2.89:1。經(jīng)卡平方測驗,基本符合隱性基因3:1的分離比例(χ2=0.3949,P=0.5211),表明lmps1突變體的類病斑早衰性狀受1對隱性核基因控制。9.lmps1基因定位用西農(nóng)1A與lmps1構(gòu)建的F2群體進行基因定位。結(jié)果顯示In Del標記ZTQ66在正常池和突變池之間存在差異,初步確定該標記與LMPS1基因連鎖。進一步在ZTQ66兩側(cè)設(shè)計新的In Del標記,根據(jù)交換單株在多態(tài)標記間的變化情況,最終LMPS1基因定位在第7染色體長臂上端粒附近的CY7-8和CY7-60之間,目標基因距這2個標記的遺傳距離分別是0.83c M和0.71c M,兩標記間物理距離約為167.3Kb。10.防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因表達量分析類病斑突變體中常伴隨防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因表達的變化,可能是類病斑突變體對病原菌抗性增強原因之一。對野生型與lmps1防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因定量分析,結(jié)果顯示,lmps1除POX22.3相對WT下調(diào)9倍外,其余POC1、PAL、PBZ1、PR1、NPR1、PR5表達量明顯升高。防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因相對于WT的表達量的變化,表明lmps1的突變可能激活部分病程相關(guān)因子,引起水稻防衛(wèi)反應(yīng)。
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【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S435.11

【參考文獻】

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本文編號：2395342