【摘要】：磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育所需的大量元素之一,參與植物體內(nèi)多種代謝過(guò)程。雖然土壤中存在大量的正磷酸鹽,但由于其高反應(yīng)活性大多被土壤中的金屬陽(yáng)離子固定成難溶磷,降低了土壤中有效磷的濃度。土壤缺磷已成為當(dāng)前農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要限制因素,所以提高植物從土壤中磷的吸收利用能力或?qū)で罂商娲姿猁}的磷肥已成為亟待解決的問(wèn)題。亞磷酸鹽脫氫酶存在于一些細(xì)菌中、能將亞磷酸鹽氧化成正磷酸鹽。若向植物中導(dǎo)入這種酶應(yīng)該可以使其轉(zhuǎn)基因植株能夠直接利用亞磷酸鹽磷肥。因此,本工作擬從土壤宏基因組中直接擴(kuò)增到假單胞菌亞磷酸鹽脫氫酶Ps Ptx的基因,通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入煙草中,并分析其轉(zhuǎn)基因煙草植株在亞磷酸鹽脅迫下的特性。取得的主要結(jié)果如下:(1)Ps Ptx的基因克隆及其表達(dá)載體的構(gòu)建以土壤宏基因組DNA為模板,通過(guò)定制的基因特異性引物,采用兩輪PCR擴(kuò)增得到全長(zhǎng)Ps Ptx基因,然后將它克隆到p BI121一衍生載體中,構(gòu)建了植物表達(dá)載體p BI121(Ps Ptx),并通過(guò)測(cè)序分析。Ps Ptx基因編碼區(qū)大小為1011 bp,其推導(dǎo)蛋白大小為336 aa(理論分子量大小為36.5 k Da)。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析表明Ps Ptx編碼蛋白屬于亞磷酸鹽脫氫酶,含有保守的NAD+結(jié)合基序和催化功能殘基;系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示Ps Ptx基因來(lái)源于一無(wú)法確定種名的土壤假單胞菌。另外,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),Ps Ptx基因能在其重組大腸桿菌中獲得高效可溶性表達(dá)。(2)Ps Ptx轉(zhuǎn)基因煙草植株的獲得以及PsPtx基因的表達(dá)分析將p BI121(Ps Ptx)轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌LBA4404中,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉片轉(zhuǎn)化法和多重PCR鑒定,獲得了陽(yáng)性Ps Ptx轉(zhuǎn)基因煙草植株。使用Trizol法分別提取野生型煙草(WT)和3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系(Ps Ptx-3,4,8)的根、莖、葉的總RNA,并反轉(zhuǎn)錄成c DNA作為模板。分別用煙草18S r RNA和Ps Ptx基因特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果表明,Ps Ptx基因在所有轉(zhuǎn)基因煙草的根、莖、葉中均有表達(dá)。(3)Ps Ptx轉(zhuǎn)基因煙草植株的特性分析a.通過(guò)野生型煙草(WT)和3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系(Ps Ptx-3,4,8)在不同濃度(1m M、3 m M、5 m M)亞磷酸鹽(Phi)MS培養(yǎng)基的脅迫實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn),亞磷酸鹽脅迫下野生型煙草(WT)的根系和根上部分受到顯著抑制且隨著亞磷酸鹽濃度的升高抑制越明顯。相反,轉(zhuǎn)基因煙草株系并沒有受到明顯的抑制,生長(zhǎng)旺盛,積累較多的生物量。b.通過(guò)在含100 mg·L-1 Kan和含3 m M亞磷酸鹽(Phi)MS培養(yǎng)基上野生型煙草(WT)和3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系(Ps Ptx-3,4,8)的生長(zhǎng)情況對(duì)比,結(jié)果表明,亞磷酸鹽對(duì)野生型煙草(WT)的抑制作用和Kan對(duì)野生型煙草的抑制作用大致相同,而Ps Ptx轉(zhuǎn)基因植株對(duì)Kan和亞磷酸鹽的抗性也幾乎一致。c.在溫室條件下,將Ps Ptx轉(zhuǎn)基因煙草種子和野生型煙草種子按1:100的比例混合播種在含亞磷酸鹽(Phi)(含量為120 mg·kg-1)的沙子和蛭石(1㑳1)混合物上生長(zhǎng),同樣發(fā)現(xiàn),野生型煙草(WT)生長(zhǎng)受到抑制,而Ps Ptx轉(zhuǎn)基因煙草能正常生長(zhǎng)。總之,這些結(jié)果表明,Ps Ptx轉(zhuǎn)基因煙草植株能利用亞磷酸鹽(Phi)并將它代謝成正磷酸鹽(Pi),以作為植物生長(zhǎng)發(fā)育所需的磷源。本工作可為未來(lái)將Ps Ptx基因應(yīng)用在主要農(nóng)作物上或提供新的轉(zhuǎn)基因篩選方法打下必要的前期基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：云南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q943.2

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本文編號(hào)：2382359