【摘要】：隨著生物醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展,基因標(biāo)志物在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的意義越來(lái)越重要,研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)眾多與疾病的發(fā)生、發(fā)展等密切相關(guān)的基因標(biāo)志物,包括基因多態(tài)性、體細(xì)胞突變、拷貝數(shù)變異以及基因甲基化水平異常等。通過(guò)檢測(cè)這些基因標(biāo)志物,我們能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)、早期診斷、療效監(jiān)測(cè)以及預(yù)后評(píng)估等。然而,由于基因標(biāo)志物往往具有豐度低、序列差異小等特點(diǎn),要求檢測(cè)方法具有較高的靈敏度、特異性及良好的定量性能,常規(guī)方法有時(shí)難以進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測(cè)。數(shù)字化PCR技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展的一種基于單分子PCR的新一代核酸定量檢測(cè)方法。其基本原理是將靶標(biāo)分子分散到一個(gè)個(gè)微小體積的反應(yīng)單元中,使每個(gè)反應(yīng)單元中所含有的靶標(biāo)分子數(shù)目不超過(guò)1個(gè),在每個(gè)反應(yīng)單元中獨(dú)立進(jìn)行單分子PCR擴(kuò)增反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后對(duì)每個(gè)反應(yīng)單元進(jìn)行檢測(cè),可以實(shí)現(xiàn)對(duì)初始核酸靶標(biāo)的絕對(duì)定量。數(shù)字化PCR技術(shù)在定量精確度、準(zhǔn)確性和靈敏度等方面均優(yōu)于傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,在核酸檢測(cè)中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。本課題在前期研究基礎(chǔ)上,利用數(shù)字化PCR方法結(jié)合水凝膠微球陣列技術(shù),實(shí)現(xiàn)了對(duì)糞便DNA中大腸癌相關(guān)的VIM基因甲基化水平異常的高靈敏、高特異性定量檢測(cè),有望應(yīng)用于基于糞便DNA檢測(cè)的大腸癌無(wú)創(chuàng)篩查中。然而,PCR擴(kuò)增是一種基于模板擴(kuò)增的方法,反應(yīng)產(chǎn)生大量與模板分子序列一致的擴(kuò)增產(chǎn)物,這些擴(kuò)增產(chǎn)物可以作為下一次擴(kuò)增反應(yīng)的模板。因此,微量的"遺留擴(kuò)增產(chǎn)物"污染就會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。核酸信號(hào)放大方法是一種通過(guò)模板分子觸發(fā)信號(hào)分子擴(kuò)增的反應(yīng),不同于PCR、LAMP等模板擴(kuò)增方法,在反應(yīng)過(guò)程中模板分子本身的數(shù)量并沒(méi)有變化,而是靶標(biāo)特異性的信號(hào)分子被循環(huán)放大,因此是避免擴(kuò)增產(chǎn)物污染的理想方法。本課題在前期研究基礎(chǔ)上,提出將信號(hào)放大反應(yīng)與數(shù)字化檢測(cè)相結(jié)合進(jìn)行單分子計(jì)數(shù)檢測(cè)的新思路。首先采用可區(qū)分單堿基序列變化的結(jié)構(gòu)特異性核酸侵入信號(hào)放大反應(yīng),將待測(cè)靶標(biāo)放大并轉(zhuǎn)化為與模板序列無(wú)關(guān)的信號(hào)分子;再通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)將擴(kuò)增的信號(hào)分子進(jìn)一步放大,產(chǎn)生放大百萬(wàn)倍以上的熒光信號(hào)分子,該熒光分子與靶標(biāo)序列無(wú)關(guān),但特異于靶標(biāo)分子。為了實(shí)現(xiàn)基于核酸侵入反應(yīng)的單分子數(shù)字化檢測(cè),我們對(duì)目前核酸侵入反應(yīng)存在的問(wèn)題進(jìn)行了改進(jìn)。首先是如何提高核酸侵入反應(yīng)對(duì)單堿基差異的識(shí)別特異性。理論上核酸侵入反應(yīng)能夠識(shí)別侵入結(jié)構(gòu)處的單個(gè)堿基差異,然而對(duì)不同位點(diǎn)的檢測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn),有些位點(diǎn)的檢測(cè)存在非特異性反應(yīng)信號(hào),導(dǎo)致難以準(zhǔn)確檢測(cè)單堿基差異。對(duì)此,我們提出在核酸侵入反應(yīng)的下游探針中人為引入錯(cuò)配堿基。通過(guò)優(yōu)化錯(cuò)配堿基的位置及錯(cuò)配堿基類型,顯著降低非特異性信號(hào),提高了核酸侵入反應(yīng)對(duì)單堿基差異檢測(cè)的特異性。其次,在常規(guī)的級(jí)聯(lián)核酸侵入反應(yīng)中,下游探針會(huì)和熒光發(fā)卡探針形成一種稱為"X"型結(jié)構(gòu)的非特異性結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)同樣能夠被FEN1核酸內(nèi)切酶識(shí)別和切割,產(chǎn)生背景信號(hào)。在進(jìn)行低拷貝靶標(biāo)的檢測(cè)時(shí),靶標(biāo)分子產(chǎn)生的陽(yáng)性信號(hào)較弱,此時(shí)背景信號(hào)會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成嚴(yán)重影響,使陽(yáng)性結(jié)果和陰性結(jié)果無(wú)法有效區(qū)分。為了降低核酸侵入反應(yīng)中"X"型結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的背景信號(hào),我們提出了一種可控延伸反應(yīng)介導(dǎo)的新型級(jí)聯(lián)核酸侵入反應(yīng)原理。該方法中,通過(guò)在下游探針和熒光探針的雜交序列之間引入一段間隔序列,避免"X"型結(jié)構(gòu)的形成,顯著降低背景信號(hào)。兩步核酸反應(yīng)通過(guò)一種可控延伸反應(yīng)進(jìn)行橋聯(lián),形成信號(hào)放大。由于背景信號(hào)被抑制,陽(yáng)性信號(hào)與背景信號(hào)區(qū)分明顯,相比于常規(guī)核酸侵入反應(yīng)方法,檢測(cè)靈敏度提高約40倍,可利用該方法進(jìn)一步建立單分子水平的核酸侵入反應(yīng)。最后,我們將所建立的基于可控延伸反應(yīng)的低背景級(jí)聯(lián)核酸侵入反應(yīng)應(yīng)用到微球-微乳相數(shù)字化擴(kuò)增檢測(cè)體系中,顯著降低了陰性反應(yīng)單元中的背景信號(hào)。利用所建立的基于微球-微乳相體系的低背景級(jí)聯(lián)核酸侵入反應(yīng),初步實(shí)現(xiàn)單分子信號(hào)擴(kuò)增數(shù)字化檢測(cè),陽(yáng)性反應(yīng)單元信號(hào)與陰性反應(yīng)單元的背景信號(hào)有明顯的區(qū)分。我們所建立的基于信號(hào)擴(kuò)增的數(shù)字化檢測(cè)方法有望成為一種高靈敏、高特異、無(wú)污染的核酸數(shù)字化檢測(cè)新方法。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R3416

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本文編號(hào)：2376894